房祥峰， 錢 江， 孟錦繡， 李東風， 吳 健

(1南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515； 廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2呼吸內(nèi)科，3醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510080)

支氣管哮喘是常見病、多發(fā)病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率逐年上升，具體發(fā)病機制尚未完全闡明[1]。氣道上皮參與調(diào)控哮喘發(fā)生和發(fā)展過程，影響哮喘炎癥程度[2-3]。哮喘個體氣道上皮完整性被破壞，氣道敏感性顯著增加，更容易被激活[4]。近年發(fā)現(xiàn)氣道上皮細胞產(chǎn)生的胞腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是哮喘發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要的上皮源性細胞因子[5]，氣道內(nèi)應(yīng)用抗體中和TSLP或阻斷氣道上皮細胞TSLP受體(TSLP receptor, TSLPR)均可上調(diào)輔助性T細胞(helper T cell，Th)1/Th2比例，抑制哮喘氣道炎癥[6-7]。如何穩(wěn)定氣道上皮微環(huán)境是控制哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。衛(wèi)生學(xué)說和Th1/Th2平衡至今仍被認為是哮喘的重要發(fā)病機制之一，本課題組前期及一些研究證實結(jié)核分枝桿菌抗原85B(antigen 85B，Ag85B)能增強Th1免疫反應(yīng)，抑制Th2免疫反應(yīng)和降低哮喘氣道炎癥[8-10]，但Ag85B如何調(diào)控哮喘的作用機制仍未被闡明，推測Ag85B可能通過靶向抑制氣道上皮產(chǎn)生TSLP-TSLPR途徑，穩(wěn)定并修飾氣道上皮的微環(huán)境，從而調(diào)控哮喘氣道炎癥和免疫反應(yīng)。

慢病毒載體具有無復(fù)制性、低細胞毒性等優(yōu)點，本研究構(gòu)建攜帶Ag85B以及增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)報告基因的Ag85B慢病毒載體，試圖從改變啟動哮喘炎癥的微環(huán)境為切入點，以具有重要黏膜屏障及免疫調(diào)控哮喘氣道炎癥雙重功能的氣道上皮細胞為研究靶細胞，建立Ag85B慢病毒感染體外培養(yǎng)的正常人支氣管上皮細胞(normal human bronchial epithelial cells，NHBEC)體系，觀察Ag85B對NHBEC TSLP和TSLPR表達的影響，探索Ag85B在哮喘氣道炎癥發(fā)生發(fā)展中可能的調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 材料

重組慢病毒系統(tǒng)、HEK 293細胞購自廣州萊德爾公司；載體主要由GV慢病毒載體系列、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體3種質(zhì)粒組成；結(jié)核分枝桿菌Ag85B真核表達質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建[9-10]；人支氣管上皮細胞株NHBEC細胞由廣東省人民醫(yī)院中心實驗室提供。

2 試劑

Trizol試劑、SYBR Green PCR SuperMix和Lipofectamine 2000購自Invitrogen；T4 DNA Ligase購于TaKaRa；兔抗人Ag85B抗體、TSLP抗體及TSLPR抗體購自Abcam；胎牛血清和LM/DMEM/HIGH培養(yǎng)基購自Hyclone；KOD Plus Neo DNA Polymerase購于ToYoBo；PCR引物由上海生工合成。

3 方法

3.1目的基因的擴增及慢病毒載體的構(gòu)建Ag85B基因的上游引物為5′-ctagtctagaATGACAGACGTGAGCCGAAAGATTC-3′，引入XbaI位點，下游引物為 5′-cgcggatccTCAGCCGGCGCCTAACGAAC-3′，引入BamH I位點。以真核表達質(zhì)粒pMG-Ag85B為模板[9-10]，PCR擴增Ag85B基因，擴增條件：94 ℃5 min；然后98 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、68 ℃ 50 s，共30個循環(huán)；68 ℃5 min。PCR產(chǎn)物以XbaI及BamH I雙酶切，37 ℃反應(yīng)3 h，T4 DNA連接酶16 ℃連接2 h。將PCR產(chǎn)物插入pLVX-IRES-Neo-EGFP載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，提取質(zhì)粒，用PCR、酶切和測序的方法鑒定重組慢病毒載體。

3.2慢病毒的包裝與生物學(xué)滴度測定 將凍存的293T細胞水浴快速融化接種于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。細胞密度達70%～80%時即可用于感染。將Lipofectamine? 2000和完全培養(yǎng)基加入到A管，完全培養(yǎng)基、重組質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒加入B管。將B管中的DNA沉淀液緩緩地逐滴加入到A管中，輕輕混勻。將沉淀混合物逐滴均勻加入到10 cm細胞培養(yǎng)皿中，輕輕晃動，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集感染48 h的含病毒培養(yǎng)上清，1 000 r/min離心5 min，上清用0.45 μm針頭濾器過濾，4 ℃條件下50 000 ×g高速離心2 h，棄上清，病毒沉淀用1 mL PBS充分溶解，再用0.22 μm濾器過濾，-80 ℃冰箱保存。50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)計算病毒滴度：取24孔板，HEK293細胞按3×104cells/well加入。24 h后，用DMEM完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋病毒，吸10 μL病毒混合液加入到相對應(yīng)的48孔板中。經(jīng)48 h感染，熒光顯微鏡觀察熒光細胞感染后生長情況。

3.3重組慢病毒感染NHBEC 待傳代細胞貼壁生長至60%～70%融合時，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗1次，加無血清DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2孵育箱孵育20 min，按感染復(fù)數(shù)(MOI)=300時加入病毒液，孵育45 min后，補加完全DMEM培養(yǎng)液使體系中血清濃度為5%，孵育4 h后全量換為完全DMEM培養(yǎng)液，48 h后檢測鑒定。

3.4Real-time PCR檢測Ag85B、TSLP和TSLPR的mRNA表達 收集病毒感染后48 h細胞，按說明書步驟提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行real-time PCR檢測。Ag85B的上游引物為5′-CAAGCTGGTCGCAAACAACA-3′，下游引物為5′-AGGTTGCTGCTACGAACGAA-3′；TSLP的上游引物為5′-TTTGGAGATAGGCAGCTTCA-3′，下游引物為5′-TCTAGCTTGCAGCGGGAAT-3′；TSLPR的上游引物為5′-TTCTCCAGGAAGGTCACACT-3′，下游引物為5′-CTGATGCCACGAAAATCTC-3′；18S rRNA的上游引物為5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，下游引物為5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。Real-time PCR 的反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s ，40個循環(huán)；融解曲線分析取60 ℃～95 ℃，采用2-ΔΔCt描述所得數(shù)據(jù)。

3.5Western blotting檢測Ag85B、TSLP和TSLPR蛋白的表達 收集病毒感染后48 h細胞，按說明書步驟提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后，分別加入抗Ag85B、TSLP和TSLPR抗體，抗體用含1%脫脂奶粉的TBST稀釋，相應(yīng)濃度分別為1∶500、1∶1 000和1∶100， 4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標記的Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL發(fā)光試劑檢測蛋白印跡條帶，光密度掃描儀掃描膠片，Gelpro32軟件分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ag85B慢病毒載體的構(gòu)建

PCR擴增的Ag85B基因片段的長度為978 bp，與預(yù)計的大小相符，測序正確后將其插入pLVX-IRES-Neo-EGFP載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，提取慢病毒載體pLVX-IRES-Neo-EGFP-Ag85B重組質(zhì)粒，經(jīng)XbaI和BamH I雙酶切，得到978 bp的目的基因片段和9 036 bp的載體片段，見圖1。

2 Ag85B慢病毒的滴度與感染效率鑒定

Ag85B慢病毒感染293T細胞，擴增、純化后，測定滴度為：2×1011TU/L。HEK293細胞被感染后，細胞形態(tài)未見明顯改變，在熒光顯微鏡下觀察有EGFP表達的細胞達90%以上，見圖2。

Figure 1. The enzyme cleavage result of pLVX-IRES-Neo-EGFP-Ag85B. M: DL2000 DNA ladder marker; Lane 1, 3, 5: recombinant lentivirus; Lane 2, 4, 6: products of enzyme digestion.

Figure 2. The HEK293 cells transfected with the Ag85B lentivi-rus (×100).

3 Ag85B在NHBEC中的表達

以氣道上皮細胞為靶細胞，將Ag85B慢病毒感染NHBEC并鑒定Ag85B mRNA及蛋白表達，探索Ag85B慢病毒可能的作用機制。Real-time PCR結(jié)果顯示，Ag85B慢病毒感染組出現(xiàn)單峰，而對照組和空病毒感染組在相應(yīng)位置未見明顯起峰，見圖3、表1。Western blotting實驗結(jié)果表明，Ag85B慢病毒感染組可見Ag85B蛋白高表達，對照組和空病毒感染組未見陽性結(jié)果，說明Ag85B慢病毒成功感染體外培養(yǎng)的人氣道上皮細胞，見圖6、表2。

4 Ag85B對NHBEC中TSLP和TSLPR表達的影響

慢病毒感染48 h后，Ag85B慢病毒感染組TSLP mRNA表達水平較對照組和空病毒感染組有下降趨勢，但無顯著差異(P>0.05)；Ag85B慢病毒感染組TSLPR mRNA水平顯著降低，分別是對照組和空病毒感染組的39%和47%，差異顯著(P<0.05)，見圖4、5及表1。

Figure 3. Performance of real-time PCR in quantification with Ag85B primers (amplification plot and melting curve).

Figure 4. Performance of real-time PCR in quantification with TSLP primers (amplification plot and meltting curve).

Figure 5. Performance of real-time PCR in quantification with TSLPR primers (amplification plot and melting curve).

表1 各組Ag85B、TSLP和TSLPR mRNA表達水平

Ag85B慢病毒感染NHBEC組的 TSLP和TSLPR蛋白表達水平均較對照組和空病毒感染組顯著降低，其TSLP蛋白表達分別是對照組和空病毒感染組的59%和49%，TSLPR蛋白表達水平分別是對照組和空病毒感染組的37%和44%(P<0.05)。對照組和空病毒感染組的TSLP和TSLPR蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，見圖6、表2。

討 論

氣道上皮細胞位于內(nèi)外環(huán)境交界處，既起重要的物理屏障作用，又是參與調(diào)控損傷、抗原暴露后氣道炎癥和免疫反應(yīng)的重要炎癥細胞[11-12]。氣道上皮細胞微環(huán)境的穩(wěn)定是控制哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，氣道上皮分泌的TSLP及其受體TSLPR是哮喘氣道炎癥的重要啟動因素，外界刺激物(抗原、病毒等)可刺激氣道上皮細胞產(chǎn)生TSLP[13]。TSLP最先于小鼠胸腺細胞系Z210R.1上清液中被發(fā)現(xiàn)，它可以維持前B細胞系的長期生存，促進非分化淋巴細胞增殖，促進樹突狀細胞成熟和na?ve Th0 細胞向Th2方向極化[14]。TSLPR是螺旋結(jié)構(gòu)的受體復(fù)合體，包括了TSLPR和IL-7α TSLPR鏈，屬于造血細胞受體家族，TSLPR和IL-7αR結(jié)合可使親和力增強。TSLPR分布廣泛，幾乎所有的參與哮喘炎癥過程的炎癥細胞上均有表達[15]。

Figure 6. The results of Western blotting for determining protein levels of Ag85B, TSLP and TSLPR in NHBEC with different treatments.

研究證明，TSLP可誘導(dǎo)Th0細胞向Th2極化，導(dǎo)致Th1/Th2比例失衡、氣道高反應(yīng)性、黏液高分泌[16-17]。氣道內(nèi)應(yīng)用TSLP抗體或TSLPR抗體可以抑制哮喘小鼠支氣管炎癥程度、降低氣道高反應(yīng)性、降低肺泡灌洗液中Th2型細胞因子(IL-4等)、上調(diào)Th1/Th2細胞比例[6-7]。流行病Meta分析證明早期接種BCG疫苗可以預(yù)防哮喘等過敏性疾病的發(fā)生，其機制可能與早期細菌等暴露促進免疫系統(tǒng)的成熟有關(guān)[18]。Ag85B是結(jié)核分枝桿菌的主要胞外分泌蛋白，是其在體外和體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分。Ag85B可以誘導(dǎo)人或鼠產(chǎn)生較強的Thl型免疫反應(yīng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，卡介苗對動物實驗性哮喘具有預(yù)防性治療作用[20]，而Ag85B DNA疫苗接種則可抑制OVA致敏哮喘鼠氣道炎癥程度，表現(xiàn)為血清和肺泡灌洗液中IgE水平下降、嗜酸性粒細胞浸潤程度降低、Th2細胞因子降低、Th1和調(diào)節(jié)性T細胞因子增高以及Th1/Th2比例恢復(fù)[9, 21]。

表2 各組Ag85B、TSLP和TSLPR的蛋白水平

應(yīng)用TSLP抗體或TSLPR抗體和Ag85B疫苗接種對哮喘炎癥的影響有相似之處，早期結(jié)核暴露可以減少哮喘發(fā)生的風險，我們推測Ag85B可能通過修飾氣道上皮的微環(huán)境，通過靶向抑制TSLP-TSLPR途徑，在源頭上改變哮喘啟動及炎癥發(fā)生的過程，從而發(fā)揮抑制哮喘氣道炎癥的作用。為此，本研究應(yīng)用Ag85B慢病毒載體感染正常人氣道上皮細胞，探究Ag85B過表達的慢病毒對體外培養(yǎng)的NHBEC產(chǎn)生TSLP、TSLPR的調(diào)控作用。選擇慢病毒作為載體是基于以下優(yōu)點：(1)含目的基因的慢病毒載體整合入宿主基因組，對轉(zhuǎn)錄沉默作用具有較強的抵抗能力，并在體外培養(yǎng)細胞實驗中能夠長期而穩(wěn)定的表達；(2)慢病毒載體可以兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子，包括細胞特異性啟動子和在基因組中普遍存在的管家基因的啟動子；(3)經(jīng)過改建后的慢病毒載體可以容納約10 kb左右的外源基因, 因此大多數(shù)的cDNA都能被克隆入慢病毒載體[22]。

本課題組用real-time PCR以及Western blotting等實驗方法證明構(gòu)建的慢病毒載體將Ag85B基因成功導(dǎo)入人支氣管上皮細胞并且過表達Ag85B mRNA及蛋白。與對照組和空病毒感染組比較，Ag85B慢病毒感染組TSLPmRNA表達有下降趨勢；而Ag85B慢病毒感染組的TSLP蛋白表達較其它兩組明顯下降，而蛋白質(zhì)是生物效能的執(zhí)行者，說明Ag85B慢病毒可以抑制TSLP的蛋白表達，并可能對后續(xù)炎癥瀑布產(chǎn)生影響。組間比較，TSLP mRNA的表達無顯著差異而蛋白水平差異顯著，我們認為造成兩者的差異表達可能有以下幾種原因：(1)Ag85B調(diào)控氣道上皮細胞TSLP mRNA的轉(zhuǎn)錄水平程度較弱，而主要調(diào)控其轉(zhuǎn)錄后水平；(2)理論上轉(zhuǎn)錄水平差異的出現(xiàn)早于翻譯水平，本實驗于感染48 h后檢測mRNA和蛋白表達，可能是因為檢測時間不夠早而未捕捉到mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異；(3)用來分析的Ag85B慢病毒感染氣道上皮細胞的病毒株樣本數(shù)偏少。Ag85B慢病毒感染后，TSLPR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，說明Ag85B慢病毒可以抑制氣道上皮TSLPR基因的信使RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達，我們認為下調(diào)表達的TSLPR可導(dǎo)致其對TSLP的親和力下降、敏感性降低，從而使炎癥狀態(tài)下氣道上皮細胞的激活閾值升高，從源頭上抑制氣道上皮分泌的炎癥因子TSLP和下游炎癥細胞上的TSLPR的結(jié)合，從而保護機體避免產(chǎn)生瀑布樣級聯(lián)效應(yīng)的哮喘氣道炎癥。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Ag85B質(zhì)?？梢砸种葡∈髿獾姥装Y，降低氣道高反應(yīng)性，增加肺部及脾臟的Th1/Th2細胞因子的比例，但是具體機制未明[9]。而TSLP-TSLPR通路在哮喘炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，氣道內(nèi)應(yīng)用抗體中和TSLP或者阻斷TSLPR可以抑制哮喘炎癥，降低Th2免疫反應(yīng)[6-7]。本研究成功建立Ag85B慢病毒感染氣道上皮細胞體系，證實Ag85B慢病毒能抑制氣道上皮細胞分泌TSLP和TSLPR，首次證實Ag85B可能通過靶向阻滯TSLP-TSLPR通路而抑制哮喘氣道炎癥的產(chǎn)生。本實驗不足之處在于未進一步分析在過敏原、炎癥因子刺激狀態(tài)下，氣道上皮細胞是否存在與基礎(chǔ)狀態(tài)不同的TSLP和TSLPR的差異表達。本課題組已成功構(gòu)建氣道滴入TSLP中和抗體抑制哮喘小鼠氣道炎癥的模型，觀察到TSLP中和抗體對哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的抑制作用(結(jié)果另文發(fā)表)。

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