曾 琪, 戚仁斌, 胡巢鳳, 陸大祥△
(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,江西 贛州 341000; 2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,廣東 廣州 510632)
小膠質(zhì)細胞廣泛分布在大腦和脊髓中。中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病過程中的免疫異常主要表現(xiàn)為小膠質(zhì)細胞過度活化,特定腦區(qū)炎癥因子水平升高[1]。在許多神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中,如帕金森病(Parkinson disease, PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)及多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)等,都出現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞的過度活化和增殖,這是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病炎癥反應(yīng)的一個重要表現(xiàn)。
文獻報道,小膠質(zhì)細胞過度活化不斷釋放一氧化氮(nitric oxide, NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase, iNOS)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、caspase-1以及其它促炎因子是導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡的原因[2-4]。這些炎癥因子對神經(jīng)元可以產(chǎn)生強烈的毒性作用,最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死。因此抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化是目前防治神經(jīng)退行性疾病的一個重要策略。
近年來,Wang等[5]發(fā)現(xiàn)一種新型的在體外具有抗炎活性的NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)家族成員PYNOD。它由PYD結(jié)構(gòu)域和NOD結(jié)構(gòu)域組成,與該家族的其它成員不同,PYNOD的C末端缺乏作為配體識別區(qū)域的富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats,LRRs),也稱NOD8[6-7]、 NLRP10、NALP10、CLR11.1或PAN5[5,8]。通過對PYNOD和炎癥相關(guān)因子構(gòu)建重組質(zhì)粒,研究其相互間的作用發(fā)現(xiàn),PYNOD有抑制由caspase-1介導(dǎo)的IL-1β分泌的作用,這是NLRs家族中首個被發(fā)現(xiàn)的對炎癥起負調(diào)節(jié)作用的成員。但PYNOD在神經(jīng)炎癥中所發(fā)揮的作用尚不清楚。本研究觀察PYNOD在LPS激活的BV2小膠質(zhì)細胞中的抗炎作用。
BV2細胞和質(zhì)粒pEGFP-C2由本室保存;pEGFP-C2-PYNOD重組質(zhì)粒由本實驗室前期構(gòu)建;大腸桿菌E.coliDH5α購自北京天根生化科技有限公司;細胞轉(zhuǎn)染所用的陽離子聚合物JetPeiTM為Polyplus產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品;胰蛋白酶購自Hyclone;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa;二甲基亞砜(DMSO)和LPS為Sigma產(chǎn)品;中分子蛋白Marker為Fermentas產(chǎn)品;Griess試劑盒購自Promega;所有抗體均購自CST;小鼠IL-1β ELISA試劑盒購自R&D;BCA法蛋白定量試劑盒購自上海申能博彩公司;硝酸纖維素膜為Millipore產(chǎn)品。
2.1MTT法檢測細胞活力 將BV2細胞以1×104/well 鋪于96孔板,每組設(shè)4個復(fù)孔,并設(shè)與實驗平行的本底對照孔。細胞長滿78%~80%后轉(zhuǎn)染PYNOD重組質(zhì)粒,孵育24 h,每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT溶液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,棄孔內(nèi)液體,加入150 μL DMSO振蕩10 min,待藍色顆粒完全溶解后,在全自動酶標(biāo)儀上檢測570 nm處的吸光度(A),以此定量反映細胞的活力。細胞活力=(加藥組A值-不加細胞組A值)/(對照組A值-不加細胞組A值)×100%。
2.2分組和給藥 用含10% 的胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)BV2細胞,0.25%胰酶消化BV2細胞,根據(jù)實驗要求,以6×104/well 密度接種在24孔細胞培養(yǎng)板上,實驗分組如下:正常對照組(negtive control);脂多糖組(LPS, 1 mg/L); PYNOD低量轉(zhuǎn)染組:0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后,給予1 mg/L LPS刺激; PYNOD中量轉(zhuǎn)染組:0.5 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后,給予1 mg/L LPS刺激; PYNOD高量轉(zhuǎn)染組:1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染24 h后,給予1 mg/L LPS刺激。
2.3Griess法測定NO含量 根據(jù)NO溶解于水后可以形成亞硝酸鹽的原理,測定培養(yǎng)基中亞硝酸鹽(NO2-)的含量,可以間接反應(yīng)細胞上清中NO的含量。將BV2細胞以6×104/well 密度接種在24孔細胞培養(yǎng)板上,貼壁過夜后,轉(zhuǎn)染處理。LPS 刺激24 h 后對NO2-進行濃度的測定。具體操作步驟如下,實驗前將試劑A、 B從4 ℃冰箱中取出,放置在室溫平衡30 min。亞硝酸鹽(nitrite)標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.56 μmol/L),用來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品以及待測樣本細胞上清液(均設(shè)3個復(fù)孔)各50 μL,加入 96孔板中,然后加入A溶液50 μL,室溫避光孵育10 min,再加入B溶液50 μL,室溫避光孵育10 min后,于30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在550 nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中NO2-含量。
2.4Real-time PCR檢測 iNOS和IL-1βmRNA的表達 參照GenBank上小鼠iNOS和IL-1β基因的公布序列,用引物設(shè)計軟件Primer 5.0對其進行引物設(shè)計。設(shè)計上、下游引物,同時以擴增GAPDH作為內(nèi)參照,由上海英駿生物公司合成。具體的引物序列見表1。
表1 引物序列
按實驗分組培養(yǎng)細胞,37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)24 h。收集細胞提取RNA并鑒定純度;按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA。Real-time PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1 μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、引物(10 mol/L)各 0.4 μL,加RNase-Free H2O 至20 μL混勻。反應(yīng)條件為:95 ℃10 s; 95 ℃30 s,62 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40 個循環(huán);于每個循環(huán)的72 ℃ 10 s末收集1次熒光信號,循環(huán)結(jié)束后執(zhí)行收集熔解曲線程序。各梯度濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3 個平行管,反應(yīng)完畢后用熒光定量分析軟件進行自動繪制擴增曲線以及熔解曲線,通過對熔解曲線的分析來檢測產(chǎn)物特異性。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后,可對各受試樣本的相對定量值進行檢測。
2.5Western blotting 檢測iNOS的蛋白水平 按實驗分組培養(yǎng)細胞,37 ℃、5% CO2培養(yǎng), LPS刺激24 h后提取細胞總蛋白,操作步驟見下:棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS 清洗3 次,每孔加 200 μL 細胞裂解液,冰上裂解 30 min,800 r/min,4 ℃離心5 min, 取上清, BCA 法蛋白定量。10% SDS- PAGE 分離蛋白, 半干法轉(zhuǎn)至 PVDF 膜。室溫下用封閉液封閉 2 h 后分別加入iNOS(1∶1000)和 GAPDH(1∶1000)抗體, 4 ℃孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次,每次10 min。將PVDF膜放于按1∶5000用TBST稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠II抗,室溫緩慢振蕩1 h 后,TBST 洗膜3 次,每次10 min。 將Western blotting 化學(xué)熒光試劑A、B 各300 μL 等量混合后,沖洗PVDF膜5 min后,于暗房中X 光片曝光,掃描儀掃描Western blotting圖像,Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析Western blotting條帶的灰度。
2.6ELISA法測定BV2細胞中IL-1β的含量 按上述分組培養(yǎng)細胞,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h;取出96孔培養(yǎng)板,4 ℃離心,200×g離心15 min,將每孔上清移至200 μL 滅菌離心管中,置-80 ℃保存?zhèn)溆谩T噭┖袕谋渲腥〕龊笾檬覝叵聫?fù)溫,雙蒸水稀釋濃縮的洗滌液(1∶20)。將標(biāo)準(zhǔn)品成比稀釋為所需的濃度。在使用前的30 min,按1∶100比列將試劑盒中提供的濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物分別稀釋為生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液,使用前30 min準(zhǔn)備。將細胞上清液樣本提前從-80 ℃冰箱中取出放置于4 ℃冰箱中,臨用平衡于室溫。實驗具體步驟參見R&D ELISA試劑盒說明書。計算每一種樣品3個復(fù)孔A值的平均值,將該值代入上述由標(biāo)準(zhǔn)品得到的直線回歸方程中,計算出細胞培養(yǎng)上清液中樣品的含量。
所有結(jié)果以SPSS 11.0軟件處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,數(shù)據(jù)比均采用單因素方差分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
如圖1,結(jié)果提示 0.1~1 ng重組質(zhì)粒pEGFP-C2-PYNOD作用BV2小膠質(zhì)細胞 24 h 后,不影響小膠質(zhì)細胞活力,與空白對照組相比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
Figure 1. The effect of pEGFP-C2-PYNOD on the activity of BV2 cells. Mean±SD. n=3.
活化的小膠質(zhì)細胞能釋放NO參與神經(jīng)炎性損傷,為了分析PYNOD抑制NO釋放的作用,采用Griess試劑間接檢測細胞上清中NO。結(jié)果見圖2,單獨轉(zhuǎn)染pEGFP-C2和pEGFP-C2-PYNOD質(zhì)粒組有少量NO釋放,單純給予LPS刺激組的細胞釋放的NO量顯著升高,轉(zhuǎn)染不同量pEGFP-C2-PYNOD 的質(zhì)粒組中,NO的釋放呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);其中0.5 μg和1.0 μg的pEGFP-C2-PYNOD轉(zhuǎn)染組NO的釋放量分別降至27 μmol/L和15 μmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示PYNOD對LPS激活的BV2細胞釋放NO有顯著抑制作用。
Figure 2. Inhibitory effect of PYNOD on the release of NO in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.
由圖 3可見,空質(zhì)粒組及PYNOD單獨處理組與 LPS 組相比較,iNOS的 mRNA 幾乎沒有表達。而各PYNOD轉(zhuǎn)染組不同程度地降低了LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞iNOS mRNA 表達,呈現(xiàn)一定劑量依賴效應(yīng)。0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組iNOS mRNA的表達量與LPS 組相比較無顯著差異,而0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組iNOS mRNA 表達量分別為LPS 組的(52.5±2.5)%和(34.3±3.2)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果提示PYNOD能在 mRNA 水平抑制LPS 誘導(dǎo)的iNOS表達。
Figure 3. Down-regulation effect of PYNOD on the expression of iNOS mRNA in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LPS alone.
通過實時熒光定量PCR 方法觀察PYNOD對IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平的影響,正常組及PYNOD單獨處理組與LPS 組相比較,IL-1β 的mRNA 有少量表達,分為LPS 組的(10.5±2.1)% 和(8.3±3.4 )% ,0.1 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組IL-1β mRNA表達量與LPS 組相比較無顯著差異,而0.5和1.0 μg各PYNOD轉(zhuǎn)染組對LPS 誘導(dǎo)BV2細胞IL-1β mRNA 生成,出現(xiàn)明顯的抑制作用,表達量與 LPS 組相比較,分別為其表達量的(55.9±6.1)% 和(38.7±4.0)%,差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果提示PYNOD可在mRNA 水平抑制LPS 激活BV2細胞表達IL-1β,見圖4。
iNOS 是合成NO 的關(guān)鍵酶,其蛋白表達量與炎癥介質(zhì)NO 的生成呈正相關(guān),本實驗采用Western blotting觀察PYNOD對LPS激活的BV2細胞iNOS 蛋白表達的影響。單純LPS刺激組,經(jīng) LPS 刺激后24 h,iNOS 的表達顯著升高,而經(jīng) 0.1~1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組的BV2細胞,LPS 誘導(dǎo)的iNOS 表達量明顯降低,呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)的下降,該結(jié)果提示PYNOD在蛋白水平可顯著抑制LPS激活的BV2細胞表達iNOS,見圖5。
Figure 4. The inhibitory effect of PYNOD on the expression of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.
Figure 5. PYNOD suppressed the production of iNOS protein in LPS-induced BV2 cells.
單純LPS刺激BV2細胞24 h 后,IL-1β濃度可達到551.5 ng/L,空白對照組為48.2 ng/L,各PYNOD轉(zhuǎn)染組均對IL-1β的分泌起到了不同程度的降低作用,呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。其中0.1、0.5 μg和1.0 μg PYNOD轉(zhuǎn)染組IL-1β的濃度分別降至442.0 ng/L、340.6 ng/L和250.3 ng/L,與LPS單獨處理組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。以上結(jié)果提示PYNOD可下調(diào)LPS 激活的BV2細胞IL-1β蛋白的表達,見圖6。
Figure 6. PYNOD decreased the release of IL-1β in LPS-stimulated BV2 cells. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs LPS alone.
腦內(nèi)活化小膠質(zhì)細胞是引發(fā)神經(jīng)炎癥的重要發(fā)病機制之一。作為腦內(nèi)最主要的免疫細胞,小膠質(zhì)細胞游走于整個腦組織中,發(fā)揮著免疫防御的功能,確保腦組織能夠正常的行使生理功能,當(dāng)Aβ蛋白、LPS或IFN-γ等刺激小膠質(zhì)細胞后[9-10],活化的小膠質(zhì)細胞通過分泌一系列的炎癥介質(zhì)(其中包括NO、IL-1β、TNF-α、PGE2、活性氧、IL-6等)和神經(jīng)毒性物質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[11-12]。近年來,隨著研究的不斷深入,通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化來緩解神經(jīng)炎癥,成為研究者所關(guān)注的焦點。
NO 的合成由3種同工酶催化:iNOS、神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal NOS,nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)。由nNOS和eNOS產(chǎn)生的NO只能持續(xù)作用幾分鐘,而由細胞因子及內(nèi)毒素等誘導(dǎo)產(chǎn)生的iNOS催化生成的NO能夠持續(xù)作用數(shù)小時[13]。目前研究認為在病理情況下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞過度表達iNOS合成大量的毒性氧自由基NO,它是造成神經(jīng)元損傷的重要原因[14-15]。IL-1β是IL-1的主要分泌形式[16-17],是一種調(diào)節(jié)蛋白,在炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。其中小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞被認為是IL-1β最主要的來源[18]。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如AD、PD和MS等,它們的發(fā)病機制都與IL-1β的上調(diào)密切相關(guān)[19-20]。
本實驗選取LPS活化BV2小膠質(zhì)細胞為實驗?zāi)P停芯縋YNOD對LPS活化的BV2小膠質(zhì)細胞釋放炎癥產(chǎn)物的影響。通過實驗發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染PYNOD 0.5 μg和1.0 μg后,可以抑制LPS激活的小膠質(zhì)細胞炎癥因子NO的釋放,并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。實時熒光定量PCR實驗證實PYNOD可抑制iNOS和IL-1β 的mRNA表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blotting實驗證實PYNOD可下調(diào)iNOS蛋白的表達,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染0.5~1.0 μg PYNOD重組質(zhì)粒對iNOS mRNA和蛋白表達的抑制作用呈一定劑量依賴關(guān)系。
本實驗首次發(fā)現(xiàn)上調(diào)BV2細胞中PYNOD的表達,可通過抑制iNOS 的mRNA和蛋白表達呈劑量依賴方式減輕LPS誘導(dǎo)的NO的生成。PYNOD還可抑制促炎癥因子IL-1β在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達。此外,本實驗表明轉(zhuǎn)染進入BV2細胞的PYNOD在發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)的同時對細胞本身無明顯的毒性作用。以上結(jié)果表明PYNOD有可能在伴有小膠質(zhì)細胞活化的神經(jīng)變性疾病的治療中發(fā)揮重要作用,具有重要的潛在價值。
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