廖于峰， 戴金華△， 茅奇峰， 竺展坤， 賈廣成

(寧波市第二醫(yī)院 1檢驗科， 2泌尿外科，浙江 寧波 315010)

前列腺癌(prostatecancer,PCa)是男性常見的惡性腫瘤，是歐美國家男性癌癥死亡原因的第2位，僅次于肺癌。在我國，前列腺癌已高居泌尿系統(tǒng)腫瘤的第3位，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化。直腸指診和血清前列腺特異性抗原(prostate-specificantigen，PSA)已經(jīng)成為前列腺癌篩查最重要的指標(biāo)，但直腸指檢的敏感性低、PSA的特異性較差，特別是在PSA(2.0～10.0μg/L)范圍內(nèi)，前列腺癌和良性前列腺增生有相當(dāng)多的重疊[1]。2009年發(fā)表在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志的2項大型研究——歐洲前列腺癌篩查隨機化研究(ERSPC)[2]和前列腺、肺、結(jié)腸和卵巢腫瘤篩查研究(PLCO)[3]表明利用PSA來篩查前列腺癌對降低死亡率以及改善生活質(zhì)量的有效性仍然不明確，PSA作為前列腺癌篩查的工具還存在很大的爭議。因此，迫切需要研究一種新的非侵入性的早期診斷前列腺癌的方法。最新研究證實，在包括前列腺癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等微觀層面，細(xì)胞可能主動或被動釋放腫瘤內(nèi)源性的miRNAs進入外周循環(huán)，成為游離miRNAs[4]。游離miRNA是外周血腫瘤標(biāo)志物，能夠用于腫瘤診斷與預(yù)后。本研究采用實時熒光定量PCR檢測PCa、良性前列腺增生(benignprostatehyperplasia,BPH)患者和健康對照血清miR-141的表達水平，研究其對前列腺癌診斷的價值，并分析miR-141的表達水平與PCa臨床病理參數(shù)的的相關(guān)性。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

收集2009年1月至2013年1月期間在我院泌尿外科經(jīng)病理活檢確診的PCa和BPH患者術(shù)前血清。其中PCa患者75例，平均年齡為(61.5±10.3)歲；BPH患者32例，平均年齡(59.4±7.8)歲。所有疾病術(shù)前未行任何治療、放療和化療。具有下列情況的個體未被納入本研究：伴發(fā)其它惡性腫瘤、心血管疾病、糖尿病、腎病或其它可能影響miRNA表達的慢性疾病等。病理分級依據(jù)2003年WHO前列腺癌病理組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)Gleason評分，腫瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期標(biāo)準(zhǔn)(即ABCD分期)。同期另擇正常志愿者40例(對照組)，年齡為(58.9±9.5)歲。3組對象年齡的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。采集標(biāo)本前獲得患者知情同意和寧波市第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有的血清標(biāo)本保存在-80 ℃。

2 方法

2.1RNA提取 取患者血清300 μL，用mirVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒(Applied Biosystems)提取總RNA。測定RNA濃度，吸光度A260/A280為1.8～2.1。

2.2實時熒光定量PCR以總RNA5μL為模板，應(yīng)用TaqManMicroRNAReverseTranscription試劑盒(ABI)進行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體系為15μL，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30min，42 ℃ 30min，85 ℃ 5min，其中反轉(zhuǎn)錄引物為miR-141特異性的莖環(huán)引物(TaqManMicroRNAAssays，ABI)。熒光定量PCR總反應(yīng)體系為20μL：1.3μLcDNA模板，1μLmiR-141 (U6) 特異性引物，10μLTaqManUniversalPCRmasterMix(ABI)，7.7μLH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10min，95 ℃ 15s，60 ℃ 1min，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI7500實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復(fù)3次，以U6為內(nèi)參基因。采用2-ΔCt計算miR-141的相對定量表達水平，其中ΔCt=CtmiR-141-CtU6。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素ANOVA分析和LSD-t檢驗。用MedCalc 7.5軟件繪制ROC曲線,分析miR-141對前列腺癌的診斷價值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常對照的血清miR-141表達水平

PCa、BPH和健康對照中血清miR-141的相對表達水平見圖1，PCa組miR-141表達水平(18.36±3.85)較BPH組(6.11±2.02)和對照組(5.50±1.52)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但miR-141在BPH組和對照組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 1. The box plot of the serum miR-141 levels in the patients with PCa (n=75) and BPH(n=52), and healthy individuals (n=40). The expression levels of miR-141 are normalized to U6. **P<0.01 vs normal group or BPH group.

2 ROC曲線分析miR-141對前列腺癌的診斷價值

用Medlac軟件構(gòu)建ROC曲線顯示miR-141能夠較好地區(qū)分前列腺癌與BPH(或健康對照)，見圖2。ROC曲線顯示，miR-141區(qū)分前列腺癌和BPH的曲線下面積和95%置信區(qū)間為0.785(95% CI∶0.689～0.823)，最佳臨界值為10.25時，敏感度和特異性分別為67.5%和70.0%(圖2A)；miR-141區(qū)分前列腺癌和健康對照的曲線下面積為0.801(95% CI∶0.723～0.868)，最佳臨界值為9.46時，敏感度和特異性分別為72.8%和76.4%(圖2B)。

Figure 2. ROC curve analysis of using miR-141 to differentiate PCa (n=75) from BPH (A, n=52), or healthy controls (B, n=40).

3 血清miR-141表達水平與PCa臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

Gleason積分>7分組與<7分組miR-141的表達量分別為16.68±2.94和23.12±4.18，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血清miR-141表達水平與臨床分期相關(guān)(P<0.01)，隨著臨床分期的增加，miR-141的表達水平增加。此外，骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌miR-141表達量與未轉(zhuǎn)移者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但miR-141表達量與腫瘤復(fù)發(fā)和PSA水平無關(guān)(均P>0.05),見表1。

討 論

miRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的、非編碼的、大小為22nt左右的單鏈小分子RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。miRNAs與靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)并不完全互補配對，從而抑制基因表達，miRNA在細(xì)胞發(fā)育、凋亡、分化、增殖等重要的生理病理過程中發(fā)揮重要作用，許多惡性腫瘤中都觀察到miRNAs的異常。近期，作為新的切入點，miRNA為癌癥的診斷與治療開辟了一條新途徑。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA不僅可以在血清中穩(wěn)定存在，并且許多腫瘤患者血清中的一些miRNA的表達明顯與正常人不同，血清miRNA有潛力作為一種特異的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。Lawrie等[5]第一個證實血清中存在腫瘤特異性miRNA ，他們發(fā)現(xiàn)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中miR-155、miR-210和miR-21表達量明顯高于正常對照組，并且miR-21 的水平與存活率密切相關(guān)。其后，Mitchell 等[4]發(fā)現(xiàn)來源于腫瘤的miRNA能夠穩(wěn)定存在于血液中，并且miRNA的表達量能夠反映腫瘤的大小，為循環(huán)miRNA的研究奠定了理論基礎(chǔ)。近來Chen等[6]發(fā)現(xiàn)血漿microRNA表達譜可作為前列腺癌非侵入性的標(biāo)志物，并且let-7c、let-7e、miR-30c、miR-622和miR-1285等5個miRNAs能夠準(zhǔn)確地區(qū)分前列腺癌和前列腺良性增生(AUC=0.924)。

表1 前列腺癌miR-141表達量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

本研究通過qRT-PCR檢測PCa、BPH和健康對照血清中miR-141的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-141在BPH和對照組中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但PCa組的miR-141表達水平明顯高于BPH組，miR-141能較好地區(qū)分前列腺癌、BPH(或健康對照)，AUC分別為0.785和0.801。Lodes等[7]和Brase等[8]也發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血液miR-141顯著升高，與本文結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)PCa患者血清miR-141水平與Gleason積分相關(guān)，Gleason積分>7的PCa患者血清miR-141水平明顯增加；隨著臨床分期的增加，miR-141的表達水平增加；并且骨轉(zhuǎn)移的PCa患者血清miR-141顯著高于未轉(zhuǎn)移者。Mitchell等[4]首先報道了進展性PCa患者循環(huán)miR-141水平明顯增高，Bryant等[9]、Yaman Agaoglu等[10]和Selth等[11]也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性PCa與miR-141水平相關(guān)，轉(zhuǎn)移性前列腺癌miR-141水平高于未轉(zhuǎn)移者。Brase等[8]表明miR-141是高風(fēng)險腫瘤的標(biāo)志物(Gleason積分>7或者遠處轉(zhuǎn)移)，循環(huán)miR-141水平與Gleason積分和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Zhang等[12]進一步發(fā)現(xiàn)血清miR-141水平越高，骨轉(zhuǎn)移病變的數(shù)目越多；并且血清miR-141的水平與血清ALP水平相關(guān)，但與血清PSA水平不相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，血清miR-141可作為前列腺癌非侵入性診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志。

目前，循環(huán)miRNA釋放入血液中的具體機制及其功能還不清楚。最近的研究表明,腫瘤細(xì)胞會選擇性地把一些miRNA包裹到微囊泡(microvesicles)中，然后釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，這些miRNA利用微囊泡經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)被運輸?shù)桨屑?xì)胞內(nèi)，并作為內(nèi)源性miRNA調(diào)控靶細(xì)胞相關(guān)基因的表達[13]。因此，循環(huán)miRNA不僅可作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，還可以通過介導(dǎo)靶細(xì)胞的表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而作為個性化治療的潛在方法。由于循環(huán)miRNA的表達量較低，尋找靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的檢測方法是miRNA應(yīng)用于臨床診斷亟待解決的問題。限于樣本數(shù)量，本研究的結(jié)果還需在大樣本、多中心的患者群體中進一步驗證。

[參 考 文 獻]

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