吳曉月， 王 歡， 劉雪靜， 廖家葳， 張 玲， 劉國(guó)慶， 黃 薇

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管研究所， 北京 100191)

Seipin基因缺陷或者突變可導(dǎo)致先天性脂肪營(yíng)養(yǎng)不良(congenital generalized lipodystrophy，CGL)[1]。它是一種常染色體隱性遺傳性疾病，患者主要表現(xiàn)為全身脂肪組織的缺失，伴有肌肉增生、脂肪肝、胰島素抵抗、心肌肥大等癥狀[2-3]。2004年Javor等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，在25例CGL病人中，88%的病人出現(xiàn)尿蛋白排泄率升高，92%的病人出現(xiàn)肌酐清除率增高。這些病人腎臟病變主要為1型或者2型膜增生性腎小球腎病，也有部分患者表現(xiàn)為硬化性腎小球腎病或糖尿病性腎病。Seipin基因缺陷作為導(dǎo)致CGL疾病家族的一員，研究發(fā)現(xiàn)，45例患者中有7名在14～35歲時(shí)死亡，其中2例死于腎功能衰竭[5]。為了研究seipin基因缺陷是否能引起腎臟損害及可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用我們研究組首次構(gòu)建的seipin基因敲除(seipin-/-)小鼠，通過(guò)對(duì)尿白蛋白含量、腎臟功能及腎臟病理改變的研究，明確seipin基因缺陷能否引起腎損害，同時(shí)對(duì)可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 6月齡體重22～25 g的雄性seipin-/-小鼠及C57BL/6野生型(wild-type, WT)小鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分為2組，每組8只。

1.2試劑和儀器 血糖測(cè)定試劑盒(中生北控);小鼠adiponectin和leptinELISA試劑盒(Millipore);小鼠insulinELISA試劑盒(上海依科賽生物)；RNA反轉(zhuǎn)及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Promega);小鼠尿白蛋白(urinaryalbumin,UAlb)ELISA試劑盒(Bethyl);實(shí)時(shí)定量PCR儀(MIResearch);小鼠代謝籠(Tecniplast);圖像分析軟件(LeicaQWIN)。

2 方法

2.1Seipin-/-小鼠基因型鑒定 小鼠離乳后剪尾消化，進(jìn)行DNA抽提，然后PCR基因型鑒定，引物序列為：loxP上游引物5’-CTTGTCTCAAAGGGGTCT-3’,下游引物5’-CAACAGAACAGACGCT-3’;PNRI上游引物5’-TCTATGGCTCCTTCTACTACTC-3’,下游引物5’-CGAATGATATGACGACGACT -3’。具體方法參照參考文獻(xiàn)[6]。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取C57BL/6小鼠各組織(見(jiàn)圖2)，其中腎臟分離腎皮質(zhì)、腎髓質(zhì)提取腎小球[7]。提取各組織總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參照，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平[8]。Seipin上游引物5’-GGCTCCTTCTACTACTCCTACA-3’，下游引物5’-CCGATCACGTCCACTCTT-3’。

2.3腎臟相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 代謝籠留取24h尿，測(cè)24h尿肌酐和尿白蛋白；動(dòng)物處死前稱重及檢測(cè)脛骨長(zhǎng)，取右腎去包膜稱重。腎臟于4% 多聚甲醛中固定，石蠟包埋，3μm切片。每個(gè)腎臟連續(xù)切片5張，過(guò)碘酸雪夫氏(PAS)染色后，隨機(jī)選取100個(gè)腎小球，采用定量圖像分析軟件，計(jì)算腎小球表面積和腎基質(zhì)表面積[9]。同時(shí)過(guò)碘酸六胺銀染色(PASM)觀察腎基質(zhì)沉積，Masson染色觀察腎纖維化情況。

2.4血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食4 h取血，離心后取血漿-20 ℃保存。血漿葡萄糖、胰島素、脂聯(lián)素及瘦素測(cè)定方法均按試劑盒說(shuō)明書操作。葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠禁食4 h，腹腔注射20% 葡萄糖2 g/kg。分別在注射后0、15、30、60和120 min采血進(jìn)行血糖測(cè)定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Seipin-/-小鼠基因鑒定

將卵細(xì)胞特異性的Cre轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與seipin基因第3外顯子兩側(cè)帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的動(dòng)物進(jìn)行雜交，得到seipin雜合子(seipin+/-)小鼠，純合子是由雜合子互相交配獲得[6]。野生型僅可擴(kuò)增出1條300 bp 的帶有l(wèi)oxP基因序列的條帶，seipin-/-小鼠則僅能擴(kuò)增出1條帶有卵細(xì)胞Cre啟動(dòng)子PNRI位點(diǎn)的1 100 bp的條帶,見(jiàn)圖1。

Figure 1. Representation of genotyping results in seipin-/- mice; +/+: wild-type mice；+/-: seipin knockout heterozygote mice; -/-: seipin knockout homozygote mice.

2 WT小鼠各組織及腎臟各部位seipin mRNA的表達(dá)水平

Seipin mRNA在6個(gè)月C57BL/6小鼠中主要表達(dá)在睪丸及脂肪，腎臟中也有表達(dá)，但是水平較低，僅為睪丸及脂肪的10%～20%，見(jiàn)圖2A。在腎臟中 seipin mRNA主要表達(dá)在腎皮質(zhì)，表達(dá)量約為髓質(zhì)的4倍，皮質(zhì)中又主要在腎小球中表達(dá)量最高，見(jiàn)圖2B。

Figure 2. Analysis of seipin mRNA expression levels in different tissues (A) and each part of the kidney (B) by qRT-PCR in C57BL/6 mice.WAT: white adipose tissue；BAT: brown adipose tissue; cortical: cortical substance of kidney; medulla: medulla of kidney.Mean±SEM.n=8.

3 Seipin-/-小鼠腎重、尿白蛋白及肌酐清除率檢測(cè)

與WT小鼠相比，seipin-/-小鼠腎臟重量顯著增加，但是腎重/體重比沒(méi)有明顯差異，這可能和小鼠seipin缺陷后肌肉增生，嚴(yán)重脂肪肝導(dǎo)致體重增加有關(guān)。因此我們使用腎重/脛骨長(zhǎng)來(lái)修正動(dòng)物間的個(gè)體差異，發(fā)現(xiàn)seipin-/-小鼠腎重/脛骨長(zhǎng)明顯高于對(duì)照組小鼠(P<0.01)。Seipin-/-小鼠24 h尿微量白蛋白(P<0.01)及肌酐清除率(P<0.01)均較WT小鼠明顯增高，見(jiàn)表1。

表1 Seipin-/-和WT雄性小鼠6個(gè)月時(shí)體重、腎重、尿白蛋白及肌酐清除率的比較

*P<0.05，**P<0.01 vsWT.

4 Seipin-/-小鼠腎臟病理改變

PASM將富含IV型膠原的腎系膜基質(zhì)、腎小球基底膜染成黑色。和WT小鼠相比，seipin-/-可見(jiàn)明顯的腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增生，見(jiàn)圖3A；D。PAS染色將基質(zhì)染成紅色，定量結(jié)果顯示seipin-/-小鼠腎小球表面積明顯增大(P<0.05)，見(jiàn)圖3G；腎小球基質(zhì)沉積增多(P<0.05)，見(jiàn)圖3H。Masson染色沒(méi)有發(fā)現(xiàn)seipin-/-小鼠出現(xiàn)明顯的腎纖維化，見(jiàn)圖3C、F。

5 Seipin-/-小鼠糖耐量、血漿胰島素、瘦素和脂聯(lián)素水平

Seipin-/-小鼠和WT小鼠相比，空腹血糖增高，糖耐量實(shí)驗(yàn)異常，血漿胰島素含量顯著增加(P<0.01)，提示seipin-/-小鼠有胰島素抵抗。由于脂肪組織的缺失，和對(duì)照組小鼠相比，seipin-/-小鼠血漿瘦素(P<0.01)及脂聯(lián)素(P<0.05)水平明顯降低，見(jiàn)圖4。

討 論

Seipin是通過(guò)定位克隆的方法于2001年由Magre等[1]從 9個(gè)先天性全身脂肪營(yíng)養(yǎng)不良的家系中篩選出來(lái)的，是一個(gè)2次跨膜蛋白，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[10]。目前seipin的研究主要集中在脂肪細(xì)胞的分化、脂解及脂滴形成上[11-12]，關(guān)于它對(duì)腎臟的影響尚不明確。

我們首次發(fā)現(xiàn)將小鼠seipin基因敲除后，小鼠出現(xiàn)了明顯的早期腎臟損傷，主要表現(xiàn)為24h尿白蛋白含量及肌酐清除率增高，腎小球肥大及腎小球基質(zhì)沉積增多。通過(guò)檢測(cè)seipinmRNA在全身各組織表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)其在睪丸及脂肪中表達(dá)量最高，在腎臟中可檢測(cè)到較低水平的seipin表達(dá)，主要位于腎小球部位。

Figure 3. Renal morphology and quantitative analysis of glomerular surface area and mesangial surface area in seipin-/- mice (×400). A,D: renal PASM staining;B,E: PAS staining; C,F: Masson staining. A,B,C: WT mice; D,E,F: seipin-/- mice; G: quantification of glomerular surface area; H: mesangial surface area.Mean±SEM.n=8.*P<0.05 vs WT group.

Figure 4. Glucose tolerance (A), plasma insulin (B), leptin (C) and adiponectin (D) levels in seipin-/- and WT mice.Mean±SEM.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs WT group.

Seipin缺失后表現(xiàn)為以脂肪缺失為主的全身代謝障礙[6]，我們?cè)趕eipin-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)由脂肪組織分泌的瘦素和脂聯(lián)素在血漿中的含量降低，同時(shí)存在明顯的胰島素抵抗(圖4)。

瘦素主要由血漿游離型發(fā)揮生理功能，參與機(jī)體能量代謝，抑制攝食，增加胰島素敏感性。瘦素分泌不足、受體缺陷或瘦素抵抗導(dǎo)致的高瘦素血癥可通過(guò)促進(jìn)胰島素抵抗、激活RAS系統(tǒng)、誘發(fā)氧化應(yīng)激及免疫功能紊亂從而促進(jìn)腎臟的損傷[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)seipin-/-小鼠有明顯的腎損傷，可能與瘦素水平下降相關(guān)。另有研究表明，CGL病人用瘦素治療后，可明顯改善胰島素抵抗及蛋白尿[15]，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌最多的因子。它可以通過(guò)NF-κB及TNF-α途徑抑制炎癥及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化和增加胰島素敏感性等作用。脂聯(lián)素的缺失，可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)尿白蛋白增高和腎臟纖維化等病變，與炎癥及氧化增高相關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)seipin-/-小鼠的腎損害與脂聯(lián)素水平下降可能也有一定關(guān)系，但目前還沒(méi)有用脂聯(lián)素治療改善CGL病人腎損傷的報(bào)道。

臨床研究發(fā)現(xiàn)88%的CGL患者均有早期腎損害的表現(xiàn)[4]，也提示seipin基因缺陷導(dǎo)致的腎損害至少部分可能是由于脂肪組織缺失后，全身代謝障礙引起。

雖然seipin在腎臟中表達(dá)水平不高， 但seipin-/-小鼠的腎損傷除了與全身代謝障礙相關(guān)外，是否與腎局部seipin表達(dá)的缺失相關(guān)將是我們下一步要研究的內(nèi)容。Seipin腎臟特異敲除小鼠將為我們解決這一問(wèn)題。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)seipin-/-小鼠出現(xiàn)明顯的腎損傷，可能與全身脂肪缺失導(dǎo)致的瘦素和脂聯(lián)素水平下降相關(guān)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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