丁 浩， 張吉翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330006)

著色性干皮病基因D(xeroderma pigmentosum D，XPD)是轉(zhuǎn)錄因子ⅡH(transcription factor ⅡH，TFⅡH)的其中一個(gè)組份[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，XPD可保護(hù)宿主細(xì)胞，阻止HIV和MMLV的感染，并下調(diào)已整合病毒的表達(dá)[2]。所以我們提出假設(shè)：XPD亦能抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制。本研究組已經(jīng)證實(shí)，XPD能升高p53的表達(dá)[3-4]。因此，我們亦可提出假設(shè)：XPD可能通過(guò)p53通路抑制HBV復(fù)制。為證實(shí)上述假設(shè)，本研究把重組人XPD質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15(整合并能復(fù)制HBV的HepG2細(xì)胞)，并使用pifithrin-α(p53抑制劑)孵育細(xì)胞，然后測(cè)定乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)的mRNA水平，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中HBV-DNA含量，探討XPD與p53對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15是由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院傳染科張軼俊博士惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；胎牛血清購(gòu)自Gibco；G418購(gòu)自Solarbio；重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，pEGFP-N2/XPD已經(jīng)通過(guò)PCR反應(yīng)、酶切及基因測(cè)序鑒定[5]；RNA提取試劑Trizol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen；p53抑制劑pifithrin-α購(gòu)自Sigma；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas；引物購(gòu)自Generay Biotech；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自天根生物；HBsAg和HBeAg的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣東中山生物工程有限公司； VERSANT HBV branched DNA (bDNA) 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bayer；HBV-DNA熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和pifithrin-α的孵育 把HepG2.2.15細(xì)胞放置于含有10%胎牛血清、400 mg/L G418和雙抗(100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素)的DMEM培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以每孔1×105細(xì)胞的密度把細(xì)胞鋪于6孔板中，24 h后細(xì)胞融合率為90%。使用LipofectamineTM2000將空載質(zhì)粒pEGFP-N2和重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，質(zhì)粒4.0 μg/well，脂質(zhì)體10 μL/well介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的第2天使用20 μmol/L pifithrin-α孵育細(xì)胞24 h。將實(shí)驗(yàn)分為5組：(1)空白對(duì)照組；(2) pEGFP-N2組；(3) pEGFP-N2/XPD組；(4)pEGFP-N2/XPD+ pifithrin-α組；(5)pifithrin-α組。

2.2RT-PCR RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。XPD上游引物5’-TCTGCCTCTGCCCTATGAT-3’，下游引物5’-CGATTCCCTCGGACACTTT-3’，產(chǎn)物大小為363 bp；HBsAg上游引物5’-AACATCAACTACCAGCACG-3’，下游引物5’-CACTGAACAAATGGCACTA-3’，產(chǎn)物大小為210 bp；HBeAg上游引物5’-CCTGCTCAAGGCAACTCT-3’，下游引物5’-GAAAGCCCTACGAACCAC-3’, 產(chǎn)物大小為182 bp；HBx上游引物5’-CACTTCGCCTCACCTCTG-3’，下游引物5’-TCGGTCGTTGACATTGCT-3’, 產(chǎn)物大小為112 bp；β-actin上游引物5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，產(chǎn)物大小為434 bp。PCR反應(yīng)體系配制如下：上、下游引物各1 μL，cDNA 500 ng，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL終體積。以下列條件進(jìn)行PCR 反應(yīng)：預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)， 94 ℃ 5 min；PCR反應(yīng)，35個(gè)循環(huán)，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 55 s；延伸，72 ℃ 7 min。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用紫外透射儀觀察電泳結(jié)果并拍照。拍照結(jié)果用BANDLEAD 3.00軟件進(jìn)行分析，以目的條帶/β-actin的吸光度比值進(jìn)行對(duì)比。

2.3ELISA配洗滌液，將濃縮洗滌液用蒸餾水或ddH2O以1∶25的比例稀釋。將待測(cè)樣品以50μL/well加入包被板，并設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照各2孔(陰性、陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入相應(yīng)對(duì)照血清各50μL，空白對(duì)照孔則加入100μL洗滌液)。立即加入酶標(biāo)記物50μL/well(空白對(duì)照孔則不加)，混勻。覆蓋封板膠，放置于37 ℃避光孵育30min。使用洗滌液洗板5次，每次均靜置1min，反扣晾干。加入底物A、B液各50μL/well，37 ℃避光顯色10min后，加入終止液50μL/well。使用酶標(biāo)儀450nm(單波長(zhǎng))以空白對(duì)照孔調(diào)零，或者用450nm/630nm(雙波長(zhǎng))，檢測(cè)各孔吸光度(A)。

2.4HBV-DNA熒光定量PCR 取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入等量的DNA濃縮液，充分混勻、離心10 min。倒去上清，沉淀中加入30 μL DNA提取液，充分混勻、離心數(shù)秒，100 ℃水浴孵育10 min，離心后備用。按試劑盒說(shuō)明書(shū)處理陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。按比例(HBV PCR反應(yīng)液40 μL/份+Taq酶3 μL/份)取相應(yīng)量PCR反應(yīng)液和Taq酶，充分混勻，按每管43 μL分裝至0.2 mL EP管中備用。向準(zhǔn)備好試劑的0.2 mL EP管中分別加入處理后的樣品(包括標(biāo)本、陰性質(zhì)控品、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品)上清液2 μL，離心，隨后放入樣品槽中。設(shè)置熒光定量PCR儀條件：93 ℃ 2 min;93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,10個(gè)循環(huán);93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,30個(gè)循環(huán)。

2.5HBVbDNA實(shí)驗(yàn) 將6孔板中的經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的細(xì)胞以PBS洗滌2次，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，離心后保留上清液，加DNaseI和RNaseA37 ℃ 孵育15min后，以EDTA和PEG8000沉淀核心顆粒，然后重懸沉淀，加裂解液孵育過(guò)夜，用酚-氯仿-異戊醇抽提，干燥后溶于50μL雙蒸水中。應(yīng)用bDNA試劑盒定量檢測(cè)HBV-DNA的滴度，其最低檢測(cè)值為0.7GEq/L。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對(duì)HBsAg、HBeAg和HBx mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組和pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α組XPD mRNA的表達(dá)明顯增多(均P<0.01)；與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達(dá)明顯減少(均P<0.01)；與空白對(duì)照組相比，pifithrin-α處理組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)；與轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α組HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達(dá)明顯增多(均P<0.01)；而空白對(duì)照組與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The changes of mRNA expression levels of XPD, HBsAg, HBeAg and HBx in HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.M: 100 bp marker; A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD+pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C;△P<0.01, △△P<0.05 vs A.

2 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響

ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯減少(均P<0.01)；與轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α組的培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量明顯增多(均P<0.01)；而空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組與pifithrin-α組三者之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見(jiàn)圖2。

Figure 2. The content of HBsAg and HBeAg in the supernatants of culture medium of HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group;D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; ##P<0.01 vs C

3 pEGFP-N2/XPD和pifithrin-α對(duì)培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中HBV-DNA含量的影響

熒光定量PCR和bDNA結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組的培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中HBV-DNA含量明顯減少(均P<0.01)；與轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組相比，pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α組的培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中HBV-DNA含量明顯增多(均P<0.01)；而空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pEGFP-N2組與pifithrin-α組三者之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

p53基因是公認(rèn)的抑癌基因，當(dāng)DNA受損時(shí)，p53先誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖，直到受損DNA被修復(fù)。如果DNA不被修復(fù)，p53就介導(dǎo)受損細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]。XPD是剪切修復(fù)基因，其蛋白有著重要的核酸剪切修復(fù)能力[7]。當(dāng)DNA受損時(shí)，XPD能活化DNA的損傷檢控點(diǎn)，能修復(fù)受損DNA，增加基因穩(wěn)定性，從而避免基因突變[8]。本研究組既往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，XPD能上調(diào)肝癌細(xì)胞中p53的表達(dá)[3-4]。

Figure 3. The content of HBV-DNA in the supernatants of culture medium and the core particles in the HepG2.2.15 cells treated with pEGFP-N2/XPD and pifithrin-α.A: blank control group; B: pEGFP-N2 group; C: pEGFP-N2/XPD group; D: pEGFP-N2/XPD + pifithrin-α group; E: pifithrin-α group.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs A or B; #P<0.01 vs C.

在我國(guó)范圍內(nèi)，乙型肝炎是造成慢性肝炎、肝纖維化以及肝癌的主要原因[9]。HBV大量復(fù)制誘發(fā)了宿主肝細(xì)胞針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答，而后者導(dǎo)致了宿主肝細(xì)胞的損害，從而造成了肝炎和肝纖維化[10]。所以，抑制HBV復(fù)制以及徹底清除宿主肝細(xì)胞內(nèi)的HBV是治療乙型肝炎的目標(biāo)。但是，現(xiàn)在針對(duì)乙型肝炎的治療方法均不甚理想，效果有限。

Yoder等[2]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XPD的核酸剪切修復(fù)功能的喪失能使得病毒MMLV在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)升高，即XPD能下調(diào)已整合的MMLV表達(dá)。所以，我們提出假設(shè)：XPD亦能抑制HBV在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。而且如前所述， XPD能升高p53表達(dá)[3-4]。因此，我們假設(shè)：XPD可能是通過(guò)p53通路來(lái)阻斷HBV復(fù)制。

為證實(shí)上述假設(shè)，本研究將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染進(jìn)入肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15，使得XPD表達(dá)增高，同時(shí)使用pifithrin-α抑制p53，然后檢測(cè)HBV復(fù)制的變化。需要指出的是，本研究使用的人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15是整合了HBV并能復(fù)制HBV的HepG2細(xì)胞株[11]。另外，本研究使用到的pifithrin-α是一種p53抑制劑，能可逆性阻斷p53依賴的基因轉(zhuǎn)錄激活[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD能下調(diào)HBsAg、HBeAg和HBx mRNA的表達(dá)，減少培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量，并減少細(xì)胞內(nèi)核心顆粒中HBV-DNA含量。這表明，XPD可抑制HBV復(fù)制。本研究還發(fā)現(xiàn)，XPD上述作用均能被pifithrin-α阻斷。這表明，XPD阻斷HBV復(fù)制是通過(guò)p53通路而實(shí)現(xiàn)的。

本研究還發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，pifithrin-α能上調(diào)HBsAg和HBeAg mRNA的表達(dá)，然而對(duì)培養(yǎng)上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的含量卻沒(méi)有明顯影響。就本研究結(jié)果來(lái)看，我們分析其可能原因是： pifithrin-α降低細(xì)胞內(nèi)HBsAg和HbeAg mRNA的表達(dá)幅度原本較小，而HBsAg、HBeAg及HBV-DNA從細(xì)胞內(nèi)釋放進(jìn)入培養(yǎng)上清液后濃度即被稀釋，這導(dǎo)致了HBsAg、HBeAg及HBV-DNA在培養(yǎng)上清液中的含量被檢測(cè)時(shí)，與空白對(duì)照相比無(wú)明顯差異。

綜上所述，XPD可通過(guò)p53通路抑制HBV復(fù)制。所以，XPD和p53可能成為乙型肝炎抗病毒治療的分子作用靶點(diǎn)，為治療乙型肝炎提供新的可能途徑。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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