孫棟勛, 黃棟棟, 金巧智, 陳武兵, 蔡志毅,△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000； 2臺州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)為我國南方高發(fā)的一種惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅我國人民的身心健康和生命安全?，F(xiàn)已知NPC不僅與EB病毒、化學(xué)致癌物等因素有關(guān)，且有一定的遺傳傾向，是一種多基因多階段侵襲性疾病。這可能與癌基因激活和抑癌基因失活所致的細(xì)胞惡性增殖致使細(xì)胞癌變的發(fā)生有關(guān)。

微小RNA(microRNA，miRNA)作為新近發(fā)現(xiàn)的又一類非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控方面起著極其重要的作用, 現(xiàn)已成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿之一[1]。miRNA主要通過與靶基因mRNA的3’-編碼區(qū)(3’-untrans latied region,3’-UTR)的不完全或完全配對，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，并通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞增殖及分化等生命活動，進(jìn)而發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用[2-4]。miRNA-7是近期發(fā)現(xiàn)的在某些腫瘤中具有抑癌作用的一類微小RNA，它的序列與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 3’-UTR區(qū)存在至少3個區(qū)域的不完全互補(bǔ)，能降低EGFR的表達(dá)[5]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在Ⅱ期和Ⅲ期非角化性鼻咽癌活檢標(biāo)本中的陽性表達(dá)率高達(dá)70.53%,并與原發(fā)瘤的進(jìn)展呈相關(guān)性[6]。此外，EGFR在鼻咽癌組織中的表達(dá)也明顯高于正常鼻咽部組織，而抑制EGFR的表達(dá)能降低鼻咽癌細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移能力[7]。這些研究結(jié)果提示，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展可能與miRNA-7通過調(diào)節(jié)EGFR及其下游通路其它關(guān)鍵因子的表達(dá)相關(guān)。本研究擬通過miRNA基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來阻斷EGFR及其下游相關(guān)通路mRNA和蛋白的表達(dá)，探討miRNA-7在體外對鼻咽癌細(xì)胞惡性增殖能力的影響及尋找鼻咽癌新的miRNA活性特異性治療靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

人低分化和高成瘤鼻咽癌5-8F細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、Opti-MEM I無血清培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco；PBS緩沖液購自Thermo；CCK-8試劑盒購自Bryotime；RNA抽提試劑Trizol reagent、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Lipo2000)和miRNA第1鏈合成試劑盒購自Invitrogen；cDNA第1鏈合成試劑盒、RealMasterMix(SYBR Green)熒光定量PCR試劑盒購自Tiangen；兔抗人GAPDH、EGFR、p-EGFR、PI3K、Akt、p-Akt單克隆Ⅰ抗購自Cell Signaling;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗購自Biosharp；miRNA-7模擬物及無關(guān)序列(negtive control，NC)由Ribobio合成。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的檢測 將5-8F細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液或傳代培養(yǎng)。實(shí)驗分3組：(1) miRNA-7+Lipo2000組 (miRNA-7組)；(2) NC+Lipo2000組 (NC組)；(3) 正常空白對照組 (control組)。將細(xì)胞以3×105cells/well接種于6孔板，2.5×103cells/well接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)液，按操作說明以等量Opti-MEM I無血清培養(yǎng)基分別稀釋適當(dāng)量的miRNA-7/NC和Lipo2000，混勻后各自室溫靜置5 min，后將兩者混勻室溫下共孵育15～20 min，加入培養(yǎng)板中，輕輕混勻，放入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，隔6～8 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染帶熒光的Cy3-NC時，所有操作均需避光操作，并以錫箔紙包被培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后用PBS沖洗1次，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。

2.2Real-time PCR檢測miRNA-7的表達(dá) 各組5-8F細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后，按照Trizol說明書中步驟抽提細(xì)胞總RNA，取RNA于紫外分光光度計下測A260/A280，比值處于1.8～2.1之間則符合純度要求。按miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄試劑，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將合成的cDNA稀釋10倍，按real-time PCR說明書配制反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)步驟：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。反應(yīng)以U6為內(nèi)參照。miRNA-7引物序列：上游引物5’-AAA AAG AAC ACG TGG AAG GAT AG-3’，下游引物5’-CCG CCT AAC GTA CCG CGA ATTT-3’。U6引物序列：上游引物5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游引物5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。記錄各孔CT值，取各孔平均值作為結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 取96孔板按上述方法轉(zhuǎn)染各組5-8F細(xì)胞，另于標(biāo)準(zhǔn)空白孔中加不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液(每組取4孔)，培養(yǎng)48h后于每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕晃混勻，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2h，再測450nm波長下每孔的A值，觀察各組細(xì)胞增殖能力變化情況。

2.4平板克隆法檢測細(xì)胞克隆形成情況 于6孔板中轉(zhuǎn)染各組5-8F細(xì)胞24 h后，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞并計數(shù)，以800 cells/well接種于新的6孔板中，并盡量使細(xì)胞均勻分布于板底，放入培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，或至肉眼可見克隆斑時，棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次后加10%甲醛固定15 min,PBS洗2次后用結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗凈后晾干，拍照。

2.5Real-timePCR檢測各mRNA的表達(dá) 按照前述方法抽提各組5-8F細(xì)胞總RNA，按cDNA第1鏈合成試劑盒說明配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用SYBRGreen熒光染料，參照試劑盒說明配制PCR反應(yīng)體系，每組設(shè)置3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)步驟： 95 ℃ 2min； 95 ℃ 15s， 60 ℃ 30s， 68 ℃ 1min，共40個循環(huán)。反應(yīng)以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH引物序列：上游引物5’-CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3’，下游引物5’-TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’；EGFR引物序列：上游引物5’-CTTGATTCCAGTGGTTCTGCTTC-3’，下游引物5’-CATCCCCTCCGTTTCTTCTTT-3’；磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinostol3-kinase,PI3K)引物序列：上游引物5’-CTGTGTGGGACTTATTGAGGTGGT-3’，下游引物5’-ACTGATGTAGTGTGTGGCTGTTGA-3’；Akt引物序列：上游引物5’-TGTGAAGGAGGGTTGGCTGC-3’，下游引物5’-ACTGCGCCACAGAGAAGTTGTT-3’。記錄各孔CT值，取3孔平均值作為結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。

2.6Western blotting檢測各蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染各組5-8F細(xì)胞72 h后，胰酶消化收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，PBS洗滌1次，每孔加入200 μL 1×SDS loading buffer，反復(fù)吹打攪拌，使細(xì)胞充分裂解，95～100 ℃煮沸10 min，10 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為樣本蛋白。順序加樣，待電泳分離完全后，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST充分洗膜后加特異性Ⅰ抗，Ⅰ抗稀釋比例為GAPDH(1∶10 000)、EGFR(1∶1 000)、p-EGFR(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶2 000)、p-Akt(1∶2 000)，4 ℃過夜孵育，Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1.5 h，充分洗膜后加ECL發(fā)光液顯影，ImageQuant LAS 4 000 Mini凝膠成像儀自動曝光，并分析灰度值，計算各組與內(nèi)參照GAPDH灰度的相對比值。每個樣本重復(fù)3次實(shí)驗。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間采用最小顯著性差異法(LSD法)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

用帶有Cy3熒光蛋白的無關(guān)序列(Cy3-NC)轉(zhuǎn)染人鼻咽癌5-8F細(xì)胞24 h后，于熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率在85%左右，見圖1。

Figure 1. The expression of Cy3 fluorescin in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 24 h after transfection (×100).

2 miRNA-7在5-8F細(xì)胞中的表達(dá)情況

人鼻咽癌5-8F細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-7或NC處理后48 h, 提取各組細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)real-time PCR 檢測結(jié)果見圖2，根據(jù)2-ΔΔCt法計算出miRNA-7在miRNA-7組、NC組及空白對照組中相對于U6的表達(dá)量分別為677.00±4.58、1.08±0.01和0.99±0.02，應(yīng)用單因素方差分析對計算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計顯示轉(zhuǎn)染后miRNA-7組的miRNA-7的表達(dá)量相對NC 組及空白對照組明顯上調(diào)(P<0.01)，NC組和control組之間則差異不明顯(P>0.05)。

Figure 2. The expression on miRNA-7 in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells after transfection with miRNA-7 mimics. Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

3 miRNA-7抑制5-8F細(xì)胞增殖情況

人鼻咽癌5-8F細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物或NC處理48 h后分別加入CCK-8試劑進(jìn)行檢測，并于450 nm 波長下檢測各孔的A值，A值越高則提示活細(xì)胞數(shù)越多，表明細(xì)胞增殖活性也越高。miRNA-7組、NC組及control組的A值分別為0.736±0.020、0.926±0.020和0.945±0.010，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示miRNA-7組的A值與NC組和control組相比，差異顯著(P<0.01)，然而NC組和control組相比則無明顯差異(P>0.05)，見圖3。結(jié)果表明，上調(diào)miRNA-7表達(dá)后5-8F細(xì)胞的增殖能力被顯著抑制。

Figure 3. The proliferation of human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells 48 h after transfection with miRNA-7 mimics by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

4 miRNA-7對細(xì)胞平板克隆形成的影響

結(jié)果顯示，miRNA-7組克隆斑形成數(shù)與NC組和control組相比明顯減少，細(xì)胞生長增殖能力明顯受抑制，而NC組和control組克隆斑形成數(shù)量則無明顯差異，見圖4。

5 miRNA-7對EGFR、PI3K及Akt mRNA表達(dá)的影響

Control組5-8F細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的mRNA表達(dá)量按1計算，結(jié)果顯示miRNA-7組EGFR、PI3K及Akt的表達(dá)量相對于control組分別為0.66±0.04、0.65±0.02和0.76±0.03，而NC組則為0.95±0.02、0.91±0.03和0.93±0.02，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示miRNA-7組5-8F細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的mRNA表達(dá)量與NC組和control組相比均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而NC組和control組之間則無顯著差異(P>0.05),見圖5。

Figure 5. The effects of miRNA-7 transfection on the mRNA expressions of EGFR/PI3K/Akt in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs mock and NC.

6 miRNA-7對EGFR/PI3K/Akt通路各蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示miRNA-7組EGFR、p-EGFR、PI3K、Akt及p-Akt相對內(nèi)參照的表達(dá)量分別為0.37±0.03、0.27±0.02、0.10±0.01、0.19±0.02和0.09±0.01，NC組為0.68±0.02、0.56±0.03、0.26±0.02、0.61±0.01和0.45±0.03，control組則分別為0.73±0.02、0.53±0.01、0.24±0.01、0.62±0.02和0.41±0.01，統(tǒng)計結(jié)果顯示miRNA-7組5-8F細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路各成員的蛋白表達(dá)量與NC組和control組相比均顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而NC組和control組之間則無明顯差異(P>0.05)。

討 論

miRNA作為真核細(xì)胞內(nèi)一類長度約19～25個寡核苷酸序列的非編碼小RNA，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等多個生物進(jìn)程中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。不同的miRNA分別相應(yīng)調(diào)控不同的mRNA，并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，且存在相對細(xì)胞和組織特異性。人類基因組中僅存在數(shù)百個miRNA，與大量的siRNA片段相比，miRNA高度保守，同時具有時序性，其作用機(jī)制目前仍不是非常清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-218在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)，可能通過Akt-mTOR通路來抑制腫瘤的增殖生長并促進(jìn)其凋亡[8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-187*在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)miR-187*表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性，并影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期。此外，miRNA-182、miRNA-100和miRNA-25等均被研究發(fā)現(xiàn)與腫瘤的形成和發(fā)展相關(guān)。本研究針對的miRNA-7作為多種miRNA 中的1種，其與腫瘤形成和發(fā)展的關(guān)系已在部分腫瘤中得已證實(shí)。在針對舌鱗狀細(xì)胞癌的研究時發(fā)現(xiàn)，miRNA-7可以介導(dǎo)下調(diào)胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R) mRNA的表達(dá)來抑制腫瘤的增殖[10]。而在肺癌中，miRNA-7過表達(dá)后可以顯著抑制Toll樣受體9(toll-like receptors 9, TLR9)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并借此來抑制腫瘤的增殖[11]。此外，在大腸癌的裸鼠移植瘤模型實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，miRNA-7的過表達(dá)可以顯著抑制瘤體的形成和生長[12]。

Figure 6. The effects of miRNA-7 transfection on the protein expression of EGFR/PI3K/Akt in human nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control and NC.

EGFR/PI3K/Akt信號通路作為引發(fā)腫瘤發(fā)生的最經(jīng)典的途徑中的1條，一直備受關(guān)注，它可以通過其各成員間一系列的級聯(lián)磷酸化反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，加快細(xì)胞侵襲、遷移以及耐受腫瘤治療等[13]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA可以介導(dǎo)調(diào)節(jié)EGFR/PI3K/Akt通路來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，那么在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中miRNA-7是否可以通過這一信號通路來影響腫瘤的惡性表型呢？為此，本研究通過體外瞬時轉(zhuǎn)染miRNA-7模擬物法來進(jìn)行一系列的實(shí)驗研究。因為對于短期(<1周)的miRNA功能獲得性細(xì)胞研究而言，miRNA模擬物瞬時轉(zhuǎn)染法是最好的選擇，這可以使miRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平短期內(nèi)急速升高并持續(xù)發(fā)揮作用。本研究熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示Lipo2000瞬時轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率在85%左右，而Real-time PCR結(jié)果提示轉(zhuǎn)染后miRNA-7的表達(dá)量的確上調(diào)了幾百倍，表明轉(zhuǎn)染的效果很顯著，這為miRNA-7短期內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其強(qiáng)效生物學(xué)活性作用提供了支持。轉(zhuǎn)染后，經(jīng)CCK-8實(shí)驗檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-7組的鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖能力較NC組及空白對照組明顯受抑制；而平板克隆形成實(shí)驗則顯示轉(zhuǎn)染后腫瘤克隆斑形成數(shù)量較對照組顯著減少，這表明miRNA-7可在體外顯著抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的增殖生長，并顯著降低其致瘤性。此外，本研究分別檢測了EGFR/PI3K/Akt通路各成員mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探究miRNA-7抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖和克隆形成的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-7組細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路各主要成員的mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)明顯下降，這表明miRNA-7在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中可以與其靶基因EGFR的mRNA有效結(jié)合，并抑制其翻譯表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游通路中各主要成員的翻譯表達(dá)。另外，EGFR/PI3K/Akt通路各主要成員的蛋白表達(dá)水平也均顯著降低，尤其是EGFR和Akt磷酸化的蛋白表達(dá)水平顯著減少，這表明體外轉(zhuǎn)染miRNA-7后，可以有效減少其靶基因EGFR的磷酸化表達(dá)水平，并更影響其下游通路成員Akt的磷酸化表達(dá)，提示miRNA-7過表達(dá)后，可在鼻咽癌5-8F細(xì)胞中顯著下調(diào)其靶向通路EGFR/PI3K/Akt各主要成員mRNA的表達(dá)，并扭轉(zhuǎn)EGFR/PI3K/Akt通路各相關(guān)成員蛋白間的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)來降低鼻咽癌5-8F細(xì)胞的成瘤和增殖能力。

綜上所述，過表達(dá)的miRNA-7可以顯著抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞的增殖和克隆形成，其作用機(jī)制可能與miRNA-7介導(dǎo)下調(diào)EGFR/PI3K/Akt通路各成員間的級聯(lián)傳遞能力有關(guān)。然而，在miRNA-7介導(dǎo)的抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖作用中，EGFR/PI3K/Akt通路的地位還有待更精確的實(shí)驗來分析，且分析EGFR/PI3K/Akt通路與其它miRNA-7的靶基因及靶向通路之間的交互作用也將是本課題組下一步研究的方向，闡明這些機(jī)制將更有助于miRNA-7介導(dǎo)的基因靶向治療作為一種新型的治療技術(shù)應(yīng)用于臨床。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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