王艷國， 李得春， 胡 海， 張 圓

(包頭醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014060)

急性缺血性腦卒中是指各種原因所致腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀，其具有發(fā)病率高、病死率高與致殘率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。缺血性腦卒中的嚴(yán)重并發(fā)癥之一是出血轉(zhuǎn)化，即腦血管在急性缺血缺氧后，血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞間隙加大，合并局部代謝物蓄積刺激，導(dǎo)致腦血管壁通透性增高，血液成分滲出，嚴(yán)重者甚至發(fā)生局部腦血管破裂，并發(fā)腦出血，造成更為嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害[1]。但是，出血轉(zhuǎn)化的機(jī)制一直不是十分明確，近年來的研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的表達(dá)與出血性轉(zhuǎn)化相關(guān)[2]。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一, 又稱為明膠酶B，生理情況下MMP-9主要生物學(xué)功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解及重構(gòu)。腦血管基底膜與間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)是維持血腦屏障完整的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分如膠原、糖蛋白、脂蛋白等均為MMP-9的作用底物，病理情況下MMP-9 可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)使血-腦屏障受損，通透性增加。國外的臨床研究[3-4]和我們的前期工作[5]均表明血漿MMP-9 水平升高的缺血性腦卒中患者比MMP-9水平未升高的患者更容易發(fā)生出血轉(zhuǎn)化，并且MMP-9 水平高低與發(fā)生出血轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重程度相關(guān)。亦有研究表明，MMP-9基因序列的-474處有轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抑制元件的序列，TGF-β1可以作用于此，在基因水平抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)降解，降低出血轉(zhuǎn)化發(fā)生率[6]。

但是，目前相關(guān)研究對(duì)急性缺血性腦卒中MMP-9和TGF-β1表達(dá)變化規(guī)律尚存爭議[7]，更重要的是缺血性腦卒中MMP-9和TGF-β1的組織來源尚不清楚，而臨床研究多通過采集血樣來開展，在確定組織來源方面較為困難。因此，本研究通過建立大鼠急性腦缺血模型，觀察急性腦缺血卒中大鼠組織中MMP-9和TGF-β1的表達(dá)情況，并對(duì)其主要組織來源進(jìn)行了初步探究；同時(shí)在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)大鼠血漿MMP-9和TGF-β1濃度的動(dòng)態(tài)變化。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

10～12周齡、體重280～330 g清潔級(jí)雄性Wis-tar大鼠，購于包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，喂養(yǎng)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，給予滅菌處理后的飼料及飲用水，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵照包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)定。

2 主要試劑及儀器

TRIzol試劑購自Invitrogen；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNase Inhibitor 、Oligo d(T)15引物和dNTP Mixture均購自TaKaRa；SYBR Green JumpStartTMTaq購自Sigma；抗大鼠MMP-9和TGF-β1抗體均購自Abcam；大鼠MMP-9和TGF-β1的ELISA檢測(cè)試劑盒購自BD；7500型Q-PCR儀購自ABI；酶標(biāo)儀購自BioRad。

3 主要方法

3.1大鼠線栓法急性腦缺血模型的建立 大鼠術(shù)前稱體重, 按7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉后, 仰臥位固定于自制的固定板上。實(shí)驗(yàn)全部選用左側(cè)大腦中動(dòng)脈，采用石蠟線栓法建立大鼠永久大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，按完全隨機(jī)化原則分為正常對(duì)照組、假處理組，每組各18只；急性缺血性卒中6 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d組，每組6只，共計(jì)72只。術(shù)后動(dòng)物蘇醒良好，送回動(dòng)物房保證水糧充足。神經(jīng)功能評(píng)分采用Zealonga 5 分制評(píng)分法：0分，不出現(xiàn)神經(jīng)功能癥狀；1分，出現(xiàn)左側(cè)Horner；2分，拎起尾巴時(shí)，右前爪不能伸直；3分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；4分，向右側(cè)傾倒；5分，死亡。1～4分視為模型成功。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP-9和TGF-β1的表達(dá) 分離海馬和大腦皮質(zhì)，分別研磨，加入TRIzol，參照說明書提供的方法抽提總RNA，將提出的腦組織總RNA溶于約10μLDEPCH2O中，總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，取1μg總RNA在 20μL體系逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。在PCR反應(yīng)管內(nèi)，先加入模板1μL，然后加入10μmol/L上、下游引物各0.5μL，SYBRGreenreal-timePCRMix10μL，用水補(bǔ)足反應(yīng)體積至20μL。Q-PCR反應(yīng)的引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列見表1。

表1 定量PCR引物序列

3.3MMP-9和TGF-β1組織化學(xué)染色 分別在6 h、12 h、1 d、2 d、6 d和14 d 時(shí)，以CO2麻醉法處死大鼠。取各組大鼠腦組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中浸泡固定24 h后入全自動(dòng)脫水儀梯度脫水，脫水后用石蠟包埋，并用石蠟切片機(jī)對(duì)蠟塊進(jìn)行5 μm厚連續(xù)冠狀切片，置于載玻片上，烤片，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇脫水。用抗大鼠MMP-9和TGF-β1抗體，按照說明書要求進(jìn)行組織化學(xué)原位染色。染色面積的比較通過軟件(Image-Pro Plus 6.0)進(jìn)行定量。

3.4ELISA檢測(cè)大鼠血漿中MMP-9和TGF-β1麻醉各時(shí)點(diǎn)模型大鼠后開腹，從下腔靜脈用肝素抗凝采血管抽血5mL，以2 000×g離心20min取上清，用于ELISA檢測(cè)。根據(jù)試劑盒說明書要求操作并且使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的A值,MMP-9和TGF-β1的表達(dá)水平以ng/L表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。Real-time PCR結(jié)果使用7500 Software V2.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功建立大鼠急性腦缺血模型

正常對(duì)照組(18只)和假手術(shù)組大鼠(18只)清醒后精神、飲食和活動(dòng)基本正常，均未發(fā)現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀和體征, 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)均為0 分。模型組大鼠清醒后出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍及食欲不振等癥狀，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)不同程度的行走時(shí)轉(zhuǎn)圈，身體向一邊傾倒，提頸時(shí)右側(cè)肢體屈曲，上抬困難甚至右側(cè)偏癱等神經(jīng)功能缺損體征，神經(jīng)功能評(píng)價(jià)為1～4 分。通過Zealonga 5 分制評(píng)分法對(duì)缺血組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，結(jié)果為： 1分10只，2分13只，3分12只，4分1只。

2 Real-time PCR 檢測(cè)缺血大鼠腦組織中MMP-9和TGF-β1的表達(dá)

正常對(duì)照組與假處理組所表達(dá)的MMP-9水平差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假處理組大鼠相比，MMP-9 mRNA水平在急性缺血6 h即開始升高，到急性缺血2 d時(shí)最高，缺血各組分別與假處理組樣本相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。而TGF-β1mRNA水平在急性缺血12 h開始升高，到急性缺血6 d時(shí)達(dá)到最高水平，之后直到14 d TGF-β1mRNA的表達(dá)水平緩慢回落。正常對(duì)照組與假處理組所表達(dá)的TGF-β1水平差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假處理組樣本相比，缺血時(shí)間為12 h、1 d、2 d、6 d和14 d的樣本差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。正常對(duì)照組與假處理組所表達(dá)的TGF-β1水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1. The mRNA level of MMP-9 in the brain of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs sham.

Figure 2. The mRNA level of TGF-β1 in the brain of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

3 組織化學(xué)染色觀察缺血大鼠腦組織中 MMP-9和TGF-β1的表達(dá)

對(duì)正常對(duì)照組、假處理組、急性腦缺血后6 h、12 h、1 d、2 d、6 d和14 d 采集的大腦切片，進(jìn)行MMP-9組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組和假處理組樣本上基本沒有MMP-9表達(dá)，而從急性腦缺血后1 d起，大腦的皮質(zhì)和海馬區(qū)域開始有MMP-9表達(dá)。急性腦缺血后2 d左右，大腦皮質(zhì)的MMP-9表達(dá)最高，對(duì)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域的MMP-9的陽性面積進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其遠(yuǎn)高于假處理組(皮質(zhì)1.76%±0.51%vs8.66%±2.08%；海馬2.83%±0.50%vs14.67%±4.04%),見圖3。而TGF-β1組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)：在急性缺血2 d后皮質(zhì)和海馬區(qū)域開始能觀察到TGF-β1表達(dá)，6 d時(shí)最明顯(皮質(zhì)1.26%±0.49%vs8.33%±2.56%；海馬1.54%±0.49%vs11.67%±3.05%)，之后開始減少,見圖4。

Figure 3. The expression of MMP-9 in rat brains 2 d after acute cerebral ischemia.Scale bar=500 μm.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham.

Figure 4. The expression of TGF-β1 in rat brains 2 d after acute cerebral ischemia. Scale bar= 500 μm.Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs sham.

4 ELISA檢測(cè)大鼠血漿中MMP-9和TGF-β1

ELISA結(jié)果顯示缺血后12 h，血漿中即可檢測(cè)到MMP-9和TGF-β1的表達(dá)。與假處理組相比，缺血1 d時(shí)2種蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5、6。

討 論

急性缺血性腦卒中現(xiàn)在已經(jīng)是心腦血管系統(tǒng)的常見病，多發(fā)病。臨床常常采用溶栓藥物加以治療，以求改善被栓塞區(qū)腦組織的功能。但是，部分急性腦缺血卒中患者常常伴發(fā)出血轉(zhuǎn)化，如果這部分人群給予溶栓治療，則會(huì)導(dǎo)致腦缺血向腦出血轉(zhuǎn)化，加重病人的組織損傷，影響神經(jīng)功能。因此，探究急性腦缺血后出血轉(zhuǎn)化的機(jī)制和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對(duì)于闡明相關(guān)病理過程，優(yōu)化治療策略，具有積極意義。

我們的前期工作通過采集多例發(fā)生了出血轉(zhuǎn)化和未出現(xiàn)出血轉(zhuǎn)化的急性腦缺血性卒中病人的血漿[4]，發(fā)現(xiàn)了MMP-9的血漿水平和出血轉(zhuǎn)化之間具有一定聯(lián)系，提示血漿MMP-9濃度高的患者更傾向于發(fā)生出血轉(zhuǎn)化。但是，收到臨床工作的實(shí)際和醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的限制，未能對(duì)MMP-9的濃度進(jìn)行多時(shí)點(diǎn)的動(dòng)態(tài)觀察。其次，急性缺血性腦卒中患者體內(nèi)MMP-9的組織來源問題一直未見明確報(bào)道，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有利于明確腦組織原位MMP-9表達(dá)情況。再次，有研究表明，在急性缺血性腦卒中時(shí)，TGF-β1可能與MMP-9的表達(dá)具有相關(guān)性，但是也缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果[8]。

Figure 5. The MMP-9 expression in the plasma of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

Figure 6. The TGF-β1 expression in the plasma of sham rats and acute cerebral ischemia rats.Mean±SD.n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs sham.

血-腦屏障主要由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管基底膜及膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成，血管基底膜與間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)是維持血腦屏障完整的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。腦組織中MMP-9的水平升高可以通過降解細(xì)胞為基質(zhì)，直接增加血腦屏障的通透性，其病理意義比血漿中MMP-9含量的意義更為重要。本研究首先成功建立了大鼠急性腦缺血模型，然后通過組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)建模后12 h，動(dòng)物的大腦皮質(zhì)和海馬即可有MMP-9表達(dá)，而以2 d時(shí)最為明顯，而對(duì)其腦組織的MMP-9 mRNA水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在缺血后6 h即開始上升，該結(jié)果與組織化學(xué)染色結(jié)果相互印證。血清中的MMP-9在缺血1 d左右顯著升高，缺血6 d達(dá)到最高峰。

TGF-β1是具有多重調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子, 其生物學(xué)作用復(fù)雜多樣,并依據(jù)不同的細(xì)胞類型和病理環(huán)境而發(fā)生變化。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為TGF-β1可促進(jìn)神經(jīng)元生存，促進(jìn)其分化, 增加神經(jīng)元的軸突數(shù)目, 并具有加速神經(jīng)組織修復(fù)的作用[6]。在本研究中，TGF-β1的表達(dá)與MMP-9的表達(dá)具有一定相關(guān)性，具體表現(xiàn)為MMP-9在急性腦缺血早期出現(xiàn)，然后緩慢回落。而TGF-β1在急性腦缺血后出現(xiàn)的時(shí)間晚于MMP-9，然后在缺血6 d 時(shí)上升到一較高水平然后回落，其內(nèi)在機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。血清中的TGF-β1在缺血1 d 左右即顯著升高，在缺血后6 d 達(dá)到峰值。但是，MMP-9的回落是否和TGF-β1相關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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