黃陽亮， 鐘 祎， 胡景鑫

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生理教研室， 廣東 廣州 510182； 2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，廣東 廣州 510080)

糖尿病性神經(jīng)痛(diabeticneuropathy,DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，以肢體末梢的慢性病理性疼痛為主要特點(diǎn)，具體表現(xiàn)為痛覺過敏、痛覺超敏和自發(fā)性疼痛[1-2]。目前其機(jī)制還不清楚，也無有效的治療和控制措施。

NF-κB在病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。各種類型的末梢神經(jīng)損傷模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion,DRG)神經(jīng)元中都有NF-κB的激活[3-4]；用不同方法抑制NF-κB的活化可以明顯阻斷神經(jīng)損傷引起的病理性疼痛[5-9]。然而在糖尿病引起的病理性疼痛中，DRG神經(jīng)元中NF-κB的作用及其機(jī)制還有待深入研究。本研究用腹腔注射鏈脲霉素(streptozocin,STZ)的方法復(fù)制大鼠糖尿病模型，痛行為檢測方法篩選出現(xiàn)慢性疼痛的動物，檢測糖尿病性神經(jīng)大鼠DRG中p-NF-κB的表達(dá)情況，及NF-κB抑制劑對大鼠痛行為的影響并進(jìn)一步分析其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動物 Sprague-Dawley雄性大鼠(220～260 g),由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持在(24±1) ℃，濕度50%～60%。

1.2主要試劑 STZ (Sigma-Aldrich)溶解于檸檬酸緩沖液(pH 4.5)中，腹腔注射STZ (65 mg/kg)復(fù)制大鼠糖尿病模型。NF-κB抑制劑PDTC (Sigma)溶解在0.9% NaCl中配成濃度為5 μmol/L的工作液。免疫組化實(shí)驗(yàn)用的Ⅰ抗為兔抗大鼠Nav1.7抗體(Sigma-Aldrich),Ⅱ抗為Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG (Jackson Immuno Research)。Western blotting實(shí)驗(yàn)用的Ⅰ抗為兔抗大鼠p-NF-κB p65 (Ser536) 抗體(Cell Signaling Technology)、兔抗大鼠 NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology)和兔抗大鼠GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)，Ⅱ抗為辣根過氧化酶(horseradish peroxidase, HRP)偶聯(lián)的羊抗兔IgG (Santa Cruz)。

2 方法

2.1大鼠糖尿病模型的制作 檸檬酸2.1 g加入100 mL雙蒸水中配成A液，檸檬酸鈉2.94 g加入100 mL雙蒸水中配成B液，A和B液以1∶1體積比混合，配成pH 4.2～4.5的檸檬酸緩沖液。將STZ溶解在上述檸檬酸緩沖液中(6.5%)，腹腔注射STZ(65 mg/kg)復(fù)制大鼠糖尿病模型。術(shù)后第4天開始尾靜脈采血測血糖，血糖高于20 mmol/L視為高血糖。

2.2痛行為測試 為了讓大鼠熟悉測試環(huán)境,消除大鼠心理因素對測試結(jié)果的影響，于測試前1周把大鼠放于測試箱內(nèi)15～20min,隔天1次, 共3次。機(jī)械性痛敏測試用vonFreyhair方法。測試箱為透明有機(jī)玻璃箱(18cm×25cm×18cm),箱底為金屬網(wǎng)制成(網(wǎng)格為0.8cm×0.8cm),通過網(wǎng)孔用vonFreyhair可以對大鼠足底部皮膚施加機(jī)械性刺激。刺激后大鼠出現(xiàn)迅速的撤足或舔足視為陽性反應(yīng)。熱超敏用的是平臺測試的方法。熱源置于玻璃板下方，對準(zhǔn)大鼠后肢加熱，測量大鼠撤足潛伏期, 每次測量要間隔5min以上，取3次測量結(jié)果的平均值。篩選出撤足閾值和撤足潛伏期明顯降低(即出現(xiàn)痛覺過敏)的模型動物做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3免疫組織化學(xué) 對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠，腹腔注射烏拉坦(1.5 g/kg)麻醉，經(jīng)主動脈快速灌注4 ℃ 肝素化的生理鹽水300 mL，然后用4%多聚甲醛300 mL 灌注30 min，解剖動物取出L4和L5 DRG，再放入4%多聚甲醛溶液中固定3 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水2 d。標(biāo)本脫水后進(jìn)行冰凍切片(厚度16 μm, Leica CM3050S)并收集于含有0.01 mol/L PBS的24孔板內(nèi),用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min，然后室溫下用封閉液(含3%驢血清的0.3% Triton X-100溶液)作用1 h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。吸去封閉液，加入兔抗大鼠Nav1.7抗體(1∶100)，4 ℃搖床上孵育48 h后，吸去Ⅰ抗，用0.01 mol/L PBS洗3次，加入Cy3標(biāo)記的驢抗兔Ⅱ抗(1∶200)，避光室溫下作用1 h， 再用0.01 mol/L PBS洗3次，隨機(jī)挑選切片貼于載玻片上，立即于熒光顯微鏡(Olympus IX71)下觀察并拍照。

2.4Westernblotting分離雙側(cè)L4～L5DRG組織,在培養(yǎng)皿中去除軟脊膜和殘留血塊,將組織迅速放入液氮罐中(10s), 隨后將組織按重量加入Tris裂解緩沖液[超純水 2.8mL, 1.0mol/LTris(pH6.8) 1mL, 10%SDS6mL, 2%β-巰基乙醇 0.2mL; 10mL配方]中,加入蛋白酶抑制劑混合物cocktail(1∶1 000;RocheMolecularBiochemicals) 和磷酸酶抑制劑 (1∶1 000), 冰上勻漿，超聲破碎, 低溫離心。 取上層含組織蛋白的液體分裝保存在-80 ℃。用Micro-BAC法測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品(50μg)加入1/10體積的上樣緩沖液,混勻沸水浴10min變性。隨后加入SDS-PAGE膠孔中,電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。常溫下5 %封閉液封閉PVDF膜1h,I抗孵育,4 ℃搖床過夜.洗脫3次,每次15min,常溫下II抗孵育2h,洗脫3次,每次15min,ECL顯色,曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用單因素方差分析(ANOVA)或t檢驗(yàn)比較組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NF-κB在糖尿病性神經(jīng)痛中的作用

本實(shí)驗(yàn)用腹腔注射STZ (65 mg/kg)的方法復(fù)制大鼠糖尿病模型。與對照組 (檸檬酸緩沖液溶劑組)相比，STZ組大鼠給藥后2周開始血糖明顯升高(血糖高于20 mmol/L)，持續(xù)至給藥后12周[6周血糖值：(25.40±6.32) mmol/L；12周血糖值：(22.80±5.24) mmol/L]。痛行為學(xué)測試方法檢測大鼠雙側(cè)后肢撤足閾值(paw withdrawal threshold, PWT)和撤足潛伏期(paw withdrawal latency, PWL)，與對照組相比，STZ組大鼠給藥后4周開始出現(xiàn)PWT和PWL明顯下降，持續(xù)至給藥后12周，見圖1。連續(xù)7 d鞘內(nèi)注射NF-κB抑制劑PDTC (5 μmol/L,每次15 μL, 每天1次；STZ給藥前1 h開始)可以明顯提高大鼠的PWT和PWL,大鼠慢性疼痛癥狀明顯減輕，見圖2。這些結(jié)果表明NF-κB的活化可能參與了STZ誘導(dǎo)的慢性糖尿病性神經(jīng)痛的形成與維持。

Figure 1. STZ induced mechanical allodynia and thermal hyperalgesia.Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs control group.

Figure 2. Blockade of NF-κB by PDTC attenuated mechanical allodynia and thermal hyperalgesia.PDTC, a potent inhibitor of NF-κB at a concentration of 5 μmol/L (in a volume of 15 μL)， was injected intrathecally 1 h before STZ and then daily for 7 days. Control group received solvent.Mean±SD.n=8. *P<0.05 vs STZ group.

2 PDTC明顯抑制STZ引起的p-NF-κB表達(dá)上調(diào)

與對照組相比，STZ組大鼠給藥后6周，L4、L5 DRG中p-NF-κB表達(dá)明顯升高，t-NF-κB總量沒有明顯變化。鞘內(nèi)注射NF-κB抑制劑PDTC可以明顯降低STZ引起的p-NF-κB表達(dá)上調(diào)，且對t-NF-κB無顯著影響，見圖3。

Figure 3. PDTC attenuates up-regulation of p-NF-κB expression in DRG induced by STZ after 6 weeks.Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs STZ group.

3 鞘內(nèi)注射PDTC明顯抑制STZ引起的大鼠L4和L5 DRG中Nav1.7表達(dá)上調(diào)

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病性神經(jīng)痛大鼠DRG神經(jīng)元中電壓門控性鈉離子通道Nav1.7表達(dá)明顯升高，時程和疼痛產(chǎn)生維持時間一致[10]。然而鈉通道上調(diào)的原因尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB的活化可以明顯降低STZ引起的Nav1.7表達(dá)上調(diào)，見圖4。這表明NF-κB激活后可能通過上調(diào)Nav1.7的表達(dá)和功能，引起神經(jīng)元興奮性增加，異常放電，從而導(dǎo)致慢性疼痛的產(chǎn)生和維持。

討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)糖尿病后，約半數(shù)大鼠會出現(xiàn)慢性疼痛癥狀。表現(xiàn)為雙側(cè)下肢的機(jī)械性痛覺過敏和熱痛覺超敏，鞘內(nèi)注射NF-κB 抑制劑PDTC可以明顯降低STZ誘導(dǎo)的L4和L5 DRG中NF-κB 磷酸化水平的升高，明顯抑制DRG中Nav1.7的表達(dá)上調(diào)，并且改善大鼠慢性疼痛的癥狀。因此NF-κB 的活化在糖尿病性神經(jīng)痛的產(chǎn)生和維持中起重要作用，其機(jī)制可能和上調(diào)DRG中的鈉通道表達(dá)和功能有關(guān)。

Figure 4. PDTC attenuated up-regulation of Nav1.7 expression in DRG neurons induced by STZ after 6 weeks.Scale bar=100 μm. Mean±SD.n=5.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs STZ group.

NF-κB在病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。各種類型的末梢神經(jīng)損傷模型大鼠DRG神經(jīng)元中都有NF-κB的激活[3-4]；用不同方法抑制NF-κB可以明顯阻斷病理性疼痛[5-9]。最近有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB上游激酶抑制性κB激酶(inhibitory kappa B kinase, IKK)的抑制劑可阻斷STZ引起的慢性疼痛，同時末梢神經(jīng)血流和神經(jīng)傳導(dǎo)速度也得到改善[11]。本研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射PDTC抑制NF-κB可以阻斷STZ引起的機(jī)械性痛覺過敏、熱痛覺超敏、DRG中p-NF-κB 的過表達(dá)。這表明IKK-NF-κB信號通路的激活是病理性疼痛產(chǎn)生的重要原因。

NF-κB活化后可以引起許多目的基因的轉(zhuǎn)錄[12]，并導(dǎo)致病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。電壓門控性鈉離子通道Nav1.7屬于河豚毒素敏感型(tetrodotoxin-sensitive，TTX-S)鈉離子通道，在DRG的感覺神經(jīng)元上有表達(dá)，并且在炎癥疼痛和神經(jīng)病理性疼痛模型動物上表達(dá)明顯增加[13-14]。高表達(dá)Nav1.7的神經(jīng)元可以表現(xiàn)出明顯的異常放電，興奮性增加[14]，然而其機(jī)制還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 的抑制劑可以明顯阻斷STZ誘導(dǎo)的Nav1.7的表達(dá)上調(diào)，這表明NF-κB活化是Nav1.7表達(dá)上調(diào)的重要原因，Nav1.7可能作為NF-κB的下游參與STZ誘導(dǎo)的糖尿病性神經(jīng)痛。

綜合以上分析，我們認(rèn)為NF-κB的激活在糖尿病性神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，活化的 NF-κB可能通過上調(diào)DRG神經(jīng)元的電壓門控性鈉通道，引起神經(jīng)元自發(fā)放電，興奮性增加，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病性神經(jīng)痛的產(chǎn)生。以NF-κB為靶點(diǎn)的藥物將有助于治療糖尿病性神經(jīng)痛。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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