梁俊清， 徐海波， 陳 檬， 王志鑫， 徐明遠， 姚 兵， 李文燕， 李輝欣， 侯 斌， 宋燕飛， 王 娜， 龐 潔

(1北京以嶺藥業(yè)有限公司，北京 102600； 2承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabeticperipheralneuro-pathy,DPN)是糖尿病最常見和最復(fù)雜的并發(fā)癥，是導(dǎo)致足潰瘍、感染以致壞疽截肢的主要危險因素，已成為糖尿病患者喪失勞動能力的主要原因之一[1]。目前對DPN仍無特效的治療方法，雖然中醫(yī)藥治療DPN有較多報道，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理研究不夠深入，目前國內(nèi)尚缺乏治療該病療效確切特別是具有創(chuàng)新理論指導(dǎo)的中成藥。中藥周絡(luò)通(Zhouluotong,ZLT)膠囊的研制開辟了應(yīng)用絡(luò)病理論治療DPN的有效新途徑[2-3]。本研究利用體外細胞水平的篩選技術(shù)篩選復(fù)方中發(fā)揮藥理作用的主要有效部位，并探討PI3K/Akt/nNOS信號通路在其改善糖尿病周圍神經(jīng)病變中的作用。

材 料 和 方 法

1 細胞株

雪旺氏細胞(Schwann cells)，購于中國科學(xué)院細胞庫。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；周絡(luò)通及其提取物Z-5、Z-6(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)；甲鈷胺對照品(中國食品藥品檢定所)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化工所)；神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak和caspase-3及磷酸化Akt 抗體(CST)；磷酸化nNOS抗體(Abcam)；熒光Ⅱ抗(LiCor)；Ca2+-ATPase試劑盒及NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)；FuGENE? HD Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega)。

3 主要方法

3.1配制高糖培養(yǎng)基 稱取一定量的D-葡萄糖溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基中(含0.1% 胎牛血清)，終濃度為100 mmol/L。用0.22 μm微孔濾器過濾除菌。

3.2配制周絡(luò)通及其提取物Z-5、Z-6貯存液 稱取一定量的周絡(luò)通溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基中，超聲促溶1 h， 6 500×g離心10 min, 收集上清液，用0.22 μm微孔濾器過濾除菌。將周絡(luò)通藥物充分溶于水提取后得到的組分用不同濃度的乙醇抽提，得到不同的藥物組分。其中Z-5是由75%乙醇抽提得到的活性部位，Z-6是由95%乙醇提取得到的活性部位。將2種提取物分別溶解于無血清DMEM培養(yǎng)基中，超聲促溶1 h，6 500×g離心10 min，收集上清液，應(yīng)用0.22 μm微孔濾器過濾除菌。實驗前利用無血清DMEM培養(yǎng)基分別稀釋成相應(yīng)濃度的工作液(含0.1%胎牛血清)。

3.3細胞的增殖率及存活率 常規(guī)培養(yǎng)待細胞貼壁后，換用含不同濃度Z-5、Z-6提取物的高糖培養(yǎng)基(100mmol/LD-葡萄糖)，培養(yǎng)48h后，測定細胞活力。采用CCK-8檢測試劑盒檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進行。

3.4細胞內(nèi)Ca2+-ATP ase活性測定 根據(jù)細胞存活率的測定結(jié)果，各組均選取5 mg/L的藥物干預(yù)濃度進行Ca2+-ATPase活性及后續(xù)指標(biāo)的測定。采用6 cm培養(yǎng)皿進行實驗，胰酶消化細胞后，收集細胞懸液，經(jīng)超聲破碎儀冰浴破碎，制備樣品液，采用Ca2+-ATPase試劑盒測定樣品酶活性。

3.5細胞凋亡百分率的測定 收集各組細胞，生理鹽水清洗2遍，待收集細胞后使用500μLbindingbuffer重懸，分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLpropidiumiodide，混勻，室溫避光反應(yīng)20min，以流式細胞儀(EPICSELITEESP)分析凋亡細胞百分比。

3.6nNOS、 Bcl-2、 Bcl-xL 、 Bax、 Bak和caspase-3及磷酸化Akt表達的測定 采用Western blotting方法檢測目的蛋白的表達，將生長良好的雪旺氏細胞以5×105/well接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%鋪滿時，以含0.1% FBS的含藥DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。處理的細胞及對照細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS洗滌后，用細胞裂解液于4 ℃裂解5 min。將全細胞裂解產(chǎn)物經(jīng)間隔2 s超聲10次后進行蛋白定量。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用nNOS、 Bcl-2、 Bcl-xL 、 Bax、 Bak和caspase-3及磷酸化Akt相應(yīng)的特異性Ⅰ抗進行孵育后，加入相應(yīng)的熒光Ⅱ抗并用Odyssey 蛋白印跡分析儀檢測目的蛋白。

3.7顯性負性突變體瞬時轉(zhuǎn)染 將生長良好的雪旺氏細胞(購于中國科學(xué)院細胞庫)以5×105cells/well接種于6cm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%～90%鋪滿時，按FuGENE?HDTransfectionReagent轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega,E2311)的說明書以5μgδp85或DN-Akt分別進行轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)24h進行實驗。

3.8NO含量的測定 將生長良好的雪旺氏細胞和轉(zhuǎn)染有突變體的細胞以1×105cells/well接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃進行培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%鋪滿時，以含0.1% FBS的含藥DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取各組細胞培養(yǎng)上清按照NO測定試劑盒說明書測定各上清中NO的含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 周絡(luò)通及其提取物對雪旺細胞生存活性的影響

與正常組細胞相比，高糖模型組細胞存活率顯著降低，突觸縮短，細胞呈圓形。給予高糖損傷的雪旺細胞以不同藥物濃度的Z-5、Z-6和周絡(luò)通干預(yù)，周絡(luò)通及其提取物Z-5對細胞生存活性的影響不明顯。與模型組相比，Z-6組在5 mg/L和10 mg/L兩個濃度時，細胞存活率顯著升高，突觸增長，細胞聯(lián)絡(luò)呈網(wǎng)狀，說明周絡(luò)通提取物Z-6能促進高糖損傷雪旺細胞的增殖發(fā)育，見圖1。

Figure 1. The relative survival rates of Schwann cells cultured with Zhouluotong and its extracts, Z-5 and Z-6, at different concentrations. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs normal； ##P<0.01 vs model.

2 周絡(luò)通及其提取物對高糖損傷的雪旺細胞Ca2+-ATPase活性的影響

與正常組(6.24% ± 0.55%)相比，模型組(3.95% ± 0.81%)細胞的Ca2+-ATPase活性顯著降低。與模型組相比，周絡(luò)通及其提取物Z-5組Ca2+-ATPase活性較模型組細胞略有下降，而Z-6組Ca2+-ATPase活性顯著升高，遠高于陽性藥甲鈷胺(mecoalamine,Meco)組，見圖2。

Figure 2. Effect of Zhouluotong and its extracts, Z-5 and Z-6, on the activity of Ca2+-ATPase. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs normal; #P<0.05 vs model.

3 周絡(luò)通提取物Z-6對高糖損傷的雪旺細胞凋亡率的影響

高糖損傷72 h后檢測細胞凋亡率，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高，與模型組相比，周絡(luò)通提取物Z-6組細胞凋亡率降低至正常水平以下，且Z-6作用明顯優(yōu)于周絡(luò)通組和甲鈷胺組，見圖3。

Figure 3. Effect of Zhouluotong and its extracts, Z-5 and Z-6, on the apoptosis of high-glucose damaged Schwann cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal; #P<0.05, ##P<0.01 vs model.

4 周絡(luò)通提取物Z-6對各組細胞nNOS和Akt蛋白磷酸化水平的影響

與正常組比較，模型組細胞的p-nNOS(S1417)和p-Akt表達均顯著降低，Z-6組、ZLT組和Meco組的p-Akt和p-nNOS(S1417)均有不同程度的升高。而各組間Akt1/2/3和nNOS表達無明顯差異，見圖4。

Figure 4. Effects of Zhouluotong extract Z-6 on nNOS and Akt phosphorylation in Schwann cells. Mean±SD. n=3.**P< 0.01 vs normal; #P<0.05 vs model.

5 周絡(luò)通及其提取物對各組細胞Bcl-2、Bcl-xL、Bax、 Bak、Cyt C 和caspase-3蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與模型組相比，周絡(luò)通提取物Z-6組抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達顯著升高(P<0.01)，同時促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bak、Cyt C和caspase-3(P<0.01)的表達水平降低，見圖5。

6 周絡(luò)通提取物Z-6對雪旺細胞分泌NO含量的影響

結(jié)果顯示，與模型組相比，Z-6組NO水平顯著升高，采用PI3K的突變體δp85 瞬時轉(zhuǎn)染Schwann細胞后，Z-6組Schwann細胞產(chǎn)生NO的量明顯減少，見圖6。

Figure 5. Effects of Zhouluotong extract Z-6 on expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bak, Cyt C and caspase-3. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs normal; #P<0.05, ##P<0.01 vs model.

Figure 6. Effect of Zhouluotong extract Z-6 on the secretion of nitric oxide in high glucose-damaged Schwann cells and the Schwann cells transfected with δp85. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs normal; ##P<0.01 vs model.

7 PI3K/Akt信號通路對周絡(luò)通提取物上調(diào)p-nNOS蛋白表達的影響

與正常組比較，Z-6組、ZLT組和Meco組細胞內(nèi)p-Akt及p-nNOS(S1417)的蛋白水平無顯著差異。采用PI3K的突變體δp85及Akt的突變體DN-Akt瞬時轉(zhuǎn)染Schwann細胞后，Z-6組p-Akt及p-nNOS的水平與正常組相比無顯著差異，見圖7。

討 論

中藥復(fù)方周絡(luò)通由黃芪、桂枝、當(dāng)歸、生地、細辛等十二味中藥組成，具有通絡(luò)祛痰止痛的功效，在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，其對糖尿病周圍神經(jīng)病變具有較為顯著的治療作用[4]，本研究試圖利用周圍神經(jīng)膠質(zhì)細胞Schwann細胞深入研究周絡(luò)通活性組分的作用靶點及其與PI3K/Akt之間的關(guān)系。

PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控糖和脂質(zhì)的代謝，是經(jīng)典的細胞存活通路，調(diào)控細胞的凋亡與增殖[5]。許多研究證實，神經(jīng)元細胞的凋亡是誘發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵因素，而PI3K/Akt信號通路中Akt能夠調(diào)控caspase家族的磷酸化達到控制凋亡的作用[6]。例如，胰島素樣生長因子I是已證實的主要通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用，而它可以顯著抑制caspase-9和caspase-3前體的剪切活化從而抑制高糖影響下細胞的凋亡[7]。

本實驗中采用高濃度葡萄糖損傷大鼠雪旺細胞模擬建立糖尿病周圍神經(jīng)病變細胞模型[8]，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率顯著升高，同時伴有caspase-3活化。加入周絡(luò)通提取物Z-6后，改善了細胞生存狀態(tài)，細胞突觸增長、細胞間聯(lián)絡(luò)呈網(wǎng)狀；而周絡(luò)通及其提取物Z-5細胞生存狀態(tài)的改變則不甚明顯。進一步研究發(fā)現(xiàn)，周絡(luò)通提取物Z-6通過提高Bcl-2、Bcl-xL抗凋亡蛋白，降低Bax、Bad等凋亡蛋白表達，減少細胞色素C釋放，降低了高糖損傷引起的細胞凋亡。

Figure 7. Effects of PI3K/Akt pathway on the p-nNOS and p-Akt up-regulation caused by Z-6. Mean±SD. n=3.

在后續(xù)實驗中，我們利用PI3K的顯性負性突變體(δp85)或Akt的顯性負性突變體(DN-Akt)阻斷nNOS的上游信號通路后，雖未證實周絡(luò)通提取物Z-6與PI3K/Akt信號通路的確切關(guān)系，但已知PI3K/Akt信號通路能夠通過產(chǎn)生神經(jīng)生長因子、磷酸化caspase、p53蛋白等方式抑制神經(jīng)細胞凋亡[9]，周絡(luò)通提取物Z-6可能通過促進Akt的磷酸化，進而保護Schwann細胞免受高糖的損傷。

另一方面，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，NO與周圍神經(jīng)的功能也有密切的關(guān)系[10-12]。例如，神經(jīng)電生理研究發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑可以調(diào)節(jié)坐骨神經(jīng)損傷后傳向神經(jīng)根背側(cè)神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)沖動。神經(jīng)系統(tǒng)中NO的含量變化主要受nNOS的磷酸化與去磷酸化調(diào)控的[13]。有研究表明，nNOS的活化主要通過胞內(nèi)Ca2+的調(diào)控和Akt的磷酸化兩條途徑[14]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的Akt和nNOS的含量變化不論是在模型組還是各個給藥組均呈正相關(guān)，更加印證了PI3K/Akt/nNOS這一通路中各分子的相關(guān)性[15]。

綜上所述，周絡(luò)通各提取物中Z-6組分對高糖環(huán)境中神經(jīng)細胞有較好的保護作用。Z-6組分對PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)nNOS和Akt的磷酸化的影響和機制有待進一步深入研究。

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