包鵬舉， 孫 瑤， 王海華， 張根葆， 胡錢國， 蔣佳珅

(皖南醫(yī)學院 1生理學教研室， 2病理生理學教研室， 3蛇毒研究所，安徽 蕪湖 241002； 4黃山市昌仁醫(yī)院，安徽 黃山 245200)

膿毒癥是由細菌和/或細菌產(chǎn)物感染和損傷引起的一種嚴重的臨床綜合征[1]，病程中常引起高熱、寒戰(zhàn)、呼吸急促和意識改變等一系列臨床癥狀，若不及時治療可進一步惡化引起休克、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminatedintravascularcoagulation，DIC)，進而誘發(fā)多系統(tǒng)功能衰竭綜合癥(multiplesystemandorganfailure，MSOF)，致死率高，危害性大，嚴重影響人們的健康[2]。臨床上現(xiàn)在除使用抗菌素及糖皮質(zhì)激素作為常規(guī)治療外，至今針對膿毒癥的各種治療手段尚未取得良好療效[2-3]，因此深入認識膿毒癥的發(fā)病機制，并積極尋求相應(yīng)的干預策略已成為研究的重要課題。皖南地區(qū)五步蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒蛋白C激活物(proteinCactivator，PCA)是從五步蛇毒粗毒中提純的一種組分[4-6]，具有防血栓、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)等作用[7-8]。目前其對膿毒癥大鼠血管張力的作用尚不清楚，機制亦不明了。為此，本實驗通過復制實驗性膿毒癥大鼠模型，采用離體胸主動脈環(huán)灌流法，初步探討五步蛇毒PCA對膿毒癥大鼠血管張力的影響及作用機制，為臨床治療膿毒癥提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

五步蛇毒PCA凍干粉由皖南醫(yī)學院蛇毒研究所提供；大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)、Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)和甲烯藍(methylene blue，MB)均為Sigma產(chǎn)品；Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L)：NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO325、CaCl22.25和glucose 5.5，均為國產(chǎn)分析純。離體血管環(huán)灌流裝置和Medlab-U/8c生物信號采集分析系統(tǒng)購自南京美易科技有限公司。

2 動物和分組

清潔級SD雄性大鼠36只，體重(220±30) g，由皖南醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(蘇)2009-0001，實驗前于清潔級環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

大鼠隨機分成假手術(shù)組(sham組)、模型組(LPS組)、PCA干預組(LPS +PCA組，分0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.6 mg/kg劑量組)、陽性對照組使用多粘菌素B(polymyxin B,PMX-B) 0.2 mg/kg，(LPS+PMX-B組)。膿毒癥模型復制成功后，LPS+PCA組、LPS+PMX-B組分別從尾靜脈注入不同劑量同容量的PCA、PMX-B；LPS組則在復制膿毒癥模型后從尾靜脈注入同容量的生理鹽水；sham組不復制膿毒癥模型，僅從尾靜脈注入同容量的生理鹽水。

3 方法

3.1實驗性膿毒癥大鼠模型復制 SD雄性大鼠腹腔注射LPS(10 mg/kg，4 h)建立實驗性膿毒癥大鼠模型[8-9]。LPS處理2 h后，動物即表現(xiàn)出盤索成團、萎靡不振、腹瀉、活動度低下并伴有發(fā)紺、震顫等癥狀；LPS處理4 h后，血壓明顯下降，但大鼠沒有死亡，說明膿毒癥的實驗動物模型復制成功(不符合上述條件的大鼠不納入實驗組內(nèi)，各實驗組大鼠不足預訂數(shù)額則通過隨機抽樣原則補齊)。

3.2大鼠血壓和心臟血流動力學指標測定 20%烏拉坦生理鹽水溶液(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，行右頸總動脈插管。經(jīng)Medlab-U/8c生物信號處理系統(tǒng)描記頸總動脈平均動脈血壓(mean arterial blood pressure，MABP)；導管繼續(xù)插入，至左心室，測定血流動力學相關(guān)指標：心率(heart rate，HR)、左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)、心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(maximal rise/fall velocity of ventricular pressure，±dp/dtmax)。監(jiān)測各指標時先穩(wěn)定30 min后，再記錄20 min。

3.3離體主動脈環(huán)的制備與穩(wěn)定[10]大鼠頸椎脫臼致死，迅速開胸，游離主動脈胸腹段，置于4 ℃氧飽和的K-H液平皿中，清除血污，仔細剔除周圍結(jié)締組織，剪成約3～4mm長的動脈環(huán)。避免過度牽拉，以防損傷血管。去除血管內(nèi)皮時，用棉簽?zāi)ゲ裂墉h(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮細胞。主動脈環(huán)套入上下平行的兩根不銹鋼微型掛鉤，水平懸掛于盛有10mLK-H液浴槽內(nèi)，下方固定，上方以一細鋼絲連于張力換能器，經(jīng)Medlab-U/8c生物信號處理系統(tǒng)記錄血管張力。主動脈環(huán)先以0g張力起步，平衡30min，逐步調(diào)節(jié)至最適初始張力1.5g并平衡1h。期間每15min換液1次，浴槽內(nèi)持續(xù)通以 95%O2+5%CO2混和氣體，并保持37 ℃恒溫水浴。待穩(wěn)定后，用60mmol/LKCl刺激收縮達峰值，然后用K-H液洗脫至基線，重復3次，以激發(fā)主動脈環(huán)最佳活性。待主動脈環(huán)重新穩(wěn)定后浴槽內(nèi)加入Phe(1×10-6mol/L)，收縮達峰值穩(wěn)定后，給予1×10-5mol/LACh，檢驗血管內(nèi)皮完整性。若加ACh后可使Phe預收縮的血管舒張達60%～90%則可認為內(nèi)皮完整；反之，則認為內(nèi)皮被破壞[11]。

3.4主動脈環(huán)收縮與舒張功能的測定 分別觀察：(1) 間隔5 min累積給予濃度為1×10-8～1×10-5mol/L Phe誘導主動脈環(huán)的收縮反應(yīng)；(2) 間隔5 min累積給予Phe達1×10-8～1×10-5mol/L誘導去內(nèi)皮主動脈環(huán)的收縮反應(yīng)；(3) 用Phe(1×10-6mol/L)收縮主動脈環(huán)，待收縮穩(wěn)定后間隔5 min累積加入濃度為1×10-8～1×10-4mol/L ACh誘導主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)；(4) 用Phe(1×10-6mol/L)收縮主動脈環(huán)，待穩(wěn)定后觀察間隔5 min累積加入濃度為1×10-9～1×10-6mol/L SNP誘導的主動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)；(5) 分別用1×10-4mol/L特異性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制劑 L-NAME及1×10-5mol/L鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，GC)抑制劑MB預處理20 min后，觀察間隔5 min累積加入濃度為1×10-8～1×10-5mol/L Phe誘導的主動脈環(huán)收縮反應(yīng)。以上每一輪實驗完成后用K-H液反復沖洗3～5次，直至主動脈環(huán)張力恢復到實驗前的基礎(chǔ)水平才開始下一輪實驗[10]。記錄主動脈環(huán)收縮幅度，并計算血管收縮率(vascular contraction rate，VCR)。VCR(%)=(累加Phe后的主動脈環(huán)收縮張力-最適初始張力)/空白組最大收縮張力平均值×100%。血管舒張率(%) = (加Phe后的主動脈環(huán)收縮張力-累加ACh 后的血管張力)/(加Phe后的血管最大收縮張力-基礎(chǔ)血管張力)×100%[10]。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組均數(shù)比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 MABP和血流動力學的變化

LPS組大鼠MABP與sham組比明顯下降(P<0.01)；PCA干預后大鼠MABP則顯著升高(P<0.05)。同sham組比較，LPS組大鼠HR、LVDP、±dp/dtmax均明顯下降(P<0.01)。LPS+PCA組左心室血流動力學各指標均有明顯升高(P<0.05)，心肌收縮力顯著改善；但與sham組比較, 仍有明顯差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠MABP和血流動力學指標的改變

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

2 PCA對Phe引起主動脈環(huán)收縮反應(yīng)的影響

LPS組主動脈環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)量效曲線比sham組明顯下降(P<0.01)；PCA干預組(尤其是0.6 mg/kg劑量組)的主動脈環(huán)對Phe刺激的收縮量效曲線顯著高于LPS組(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Effects of phenylephrine (1×10-8～1×10-5 mol/L) on the tension of the rat aorta rings. Mean±SD. n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs sham group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.

3 PCA對Phe引起去內(nèi)皮主動脈環(huán)收縮反應(yīng)的影響

同sham組比較，LPS組去內(nèi)皮主動脈環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)量效曲線顯著降低(P<0.01)；而LPS+PCA組去內(nèi)皮主動脈環(huán)對Phe的收縮反應(yīng)與LPS組相比則無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

4 PCA對ACh引起主動脈環(huán)舒張反應(yīng)的影響

LPS組主動脈環(huán)對ACh引起的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)較sham組明顯降低(P<0.01)，PCA干預組(尤其是0.6 mg/kg劑量組)對1×10-4mol/L ACh誘導的舒張反應(yīng)較LPS組顯著增加(P<0.01)，見表2。

Figure 2. Effects of phenylephrine (1×10-8～1×10-5 mol/L) on the tension of the rat aorta rings with endothelium denudation. Mean±SD. n=6. *P<0.05, ** P<0.01 vs sham group; #P<0.05, ##P<0.01 vs LPS group.

表2 各組大鼠主動脈環(huán)對ACh誘導的舒張反應(yīng)

*P<0.05,**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsLPS group.

5 PCA對SNP引起主動脈環(huán)舒張反應(yīng)的影響

用1×10-6mol/L Phe收縮主動脈環(huán)，待穩(wěn)定后觀察間隔5 min累積加入濃度為1×10-9～1×10-6mol/L SNP誘導主動脈環(huán)非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。各組主動脈環(huán)對SNP誘導的舒張反應(yīng)無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠主動脈環(huán)對SNP誘導的舒張反應(yīng)

6 不同抑制劑預處理后主動脈環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)

經(jīng)L-NAME(1×10-4mol/L)和MB(1×10-5mol/L)預處理20 min后，各組主動脈環(huán)對Phe誘導的收縮幅度均有所升高。但L-NAME或MB預處理前后相比較，PCA干預組(0.6 mg/kg)對1×10-5mol/L Phe誘導的收縮幅度的差值同sham組相比無顯著差異(P>0.05)，卻明顯低于LPS組(P<0.05)，見表4、5。

表4 主動脈環(huán)經(jīng)L-NAME預處理后對Phe刺激的收縮反應(yīng)

△△P<0.01vssham;□□P<0.01vsLPS;○P<0.05,○○P<0.01vsLPS+0.1 mg/kg PCA;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsLPS+0.3 mg/kg PCA;■P<0.05,■■P<0.01vsLPS+0.6 mg/kg PCA;●●P<0.01vsLPS+PMX-B;*P<0.05,**P<0.01vssham+L-NAME;#P<0.05vsLPS+L-NAME.

表5 主動脈環(huán)經(jīng)MB預處理后對Phe刺激的收縮反應(yīng)

△△P<0.01vssham;□□P<0.01vsLPS;○P<0.05,○○P<0.01vsLPS+0.1 mg/kg PCA;▲▲P<0.01vsLPS+0.3 mg/kg PCA;■■P<0.01vsLPS+0.6 mg/kg PCA;●●P<0.01vsLPS+PMX-B;*P<0.05,**P<0.01vssham+MB;#P<0.05,##P<0.01vsLPS+MB.

討 論

膿毒癥病情兇險，病死率高，臨床治療困難，已成為現(xiàn)代危重病醫(yī)學面臨的突出難題[12]。盡管現(xiàn)代醫(yī)學對疾病的研究方法有了很大進步，但在對膿毒癥的臨床治療上，僅是包括使用抗生素、清除感染等常規(guī)支持療法[1]，并未取得突破性的進展。

目前對膿毒癥發(fā)病機制的研究歸益于多種動物實驗?zāi)Ｐ偷慕?，主要有直接注射外源毒?LPS、zymogen等)、盲腸結(jié)扎穿孔法(ceacal ligation and puncture，CLP)、腹腔包埋污穢物等[9]，而眾方法中又以注射LPS最為常用，可以在短時間內(nèi)使模型動物達到膿毒癥晚期，且方法簡單方便有效[13]。本實驗通過腹腔注射LPS建立實驗性膿毒癥大鼠模型。實驗證實，LPS處理4 h后，大鼠的MABP、HR、LVDP、±dp/dtmax等心功能指標較sham組均明顯降低，這與臨床膿毒癥的發(fā)展特征十分吻合[14]。

膿毒癥發(fā)生時的主要特征表現(xiàn)為全身血壓不可逆性降低，而血管張力的調(diào)節(jié)無疑是參與血壓調(diào)節(jié)的眾多因素中主要因素之一。故本實驗采用離體血管灌流法，初步探討五步蛇毒PCA對膿毒癥大鼠血管張力的影響及其可能機制。

既往研究[5-8]證實本實驗室前期從五步蛇毒粗毒中已提純出蛋白C 激活劑組分，具有抗血栓、改善微循環(huán)等效應(yīng)，但目前其對血管作用機制研究尚未見相關(guān)報道。本研究中離體主動脈環(huán)灌流實驗結(jié)果顯示，LPS+PCA組主動脈環(huán)對Phe刺激的收縮反應(yīng)量效曲線比LPS組明顯升高，而在去除主動脈環(huán)內(nèi)皮后則與LPS組無顯著差別。通常情況下由血管內(nèi)皮細胞上的M受體介導的血管舒張作用總是強于血管平滑肌細胞M受體介導的血管收縮作用，因此只要內(nèi)皮存在時ACh總是引起血管舒張，血管內(nèi)皮損傷時ACh的舒張作用就會減弱[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，LPS組主動脈環(huán)對ACh內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)明顯降低，而經(jīng)PCA干預(特別是0.6 mg/kg劑量組)主動脈環(huán)對ACh舒張反應(yīng)較LPS組顯著增加；另外，實驗還觀察到各組主動脈環(huán)對累積濃度的SNP非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)均無明顯差異。由此可推測五步蛇毒PCA可通過保護血管內(nèi)皮功能改善膿毒癥大鼠血管低反應(yīng)性。

為進一步闡明PCA改善膿毒癥血管低反應(yīng)性的作用機制，實驗分別使用一氧化氮合酶抑制劑L-NAME、GC抑制劑MB預處理主動脈環(huán)。一般認為，血管內(nèi)皮細胞通過NOS催化L-精氨酸與氧結(jié)合后釋放NO，NO激活細胞GC，活化的GC使三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷(cyclie guanosine monophosphate，cGMP)，使細胞內(nèi)cGMP水平升高，繼而激活cGMP依賴性的蛋白激酶PKG，使細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，促使肌球蛋白輕鏈脫磷酸化，平滑肌松弛，血管舒張[15-16]。LPS及其誘導產(chǎn)生的細胞因子刺激NOS過量表達，繼而生成高濃度NO，在體內(nèi)發(fā)揮負性肌力作用，尤其是可通過NO-GC-cGMP通路降低平滑肌細胞游離鈣的水平，介導血管的低反應(yīng)性[15]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠主動脈環(huán)經(jīng)L-NAME、MB預處理后對Phe刺激的收縮反應(yīng)均有不同程度升高，尤其是LPS組主動脈環(huán)收縮明顯增強。但L-NAME預處理組與未處理組比較，0.6 mg/kg PCA干預組主動脈環(huán)對1×10-5mol/L Phe引起的收縮幅度的差值顯著低于LPS組，提示PCA可明顯降低由LPS誘導的NOS過量表達，繼而也相應(yīng)減少NO過量生成。再者，MB預處理前后比較，LPS組主動脈環(huán)收縮反應(yīng)升高幅度的差值同樣也明顯高于sham組，PCA干預組則和sham組無顯著差異，這也說明LPS組主動脈環(huán)通過NO-GC-cGMP途徑對NO的敏感性較sham組高，而PCA可經(jīng)NO-GC-cGMP通路降低對NO的敏感性，增強主動脈平滑肌的收縮反應(yīng)，繼而逆轉(zhuǎn)膿毒癥發(fā)生時由血管低反應(yīng)性引起的低血壓。

綜上所述，本實驗認為五步蛇毒PCA對膿毒癥大鼠血管內(nèi)皮功能有保護作用，通過抑制NO-GC-cGMP信號通路，防止iNOS過度活化及NO的過量生成，從而改善膿毒癥大鼠血管的低反應(yīng)性，至于其確切機制尚需進一步研究。

[參 考 文 獻]

[1] 莫 冰，劉占國，常 平．細胞外組蛋白對膿毒癥的影響[J]．中華危重病急救醫(yī)學，2014，26(3):204-205．

[2] Shiramizo SC, Marra AR, Dur?o MS, et al. Decreasing mortality in severe sepsis and septic shock patients by implementing a sepsis bundle in a hospital setting[J]. PLoS One, 2011, 6(11):e26790．

[3]StevensJH,O’HanleyP,ShapiroJM,etal.Effectsofanti-C5aantibodiesontheadultspiratorydistresssyndromeinsepticprimates[J].JClinInvest, 1986, 77(6):1812-1816．

[4] 張根葆，張 毅，孔 巖，等．五步蛇毒蛋白C激活劑的純化與活性分析[J]．蛇志， 2008，20(4):249-251．

[5] 孫 瑤，張根葆，吳 娟．影響五步蛇毒蛋白C激活劑酰胺酶活性的實驗因素[J]．皖南醫(yī)學院學報， 2010, 29(6):409-411．

[6] 孫 瑤，包鵬舉，張根葆．毛細管區(qū)帶電泳分析五步蛇毒蛋白C激活劑和蛋白C的相互作用[J]．色譜， 2013, 33(1):59-63．

[7] 張根葆，陳冬云，周志泳，等．蝮蛇毒蛋白C激活物的純化與抗血小板活性[J]．皖南醫(yī)學院學報，2005, 24(1):8-10．

[8] 王海華，許 敏，張 翠，等．蝮蛇毒蛋白C激活物對敗血癥大鼠心臟血流動力學的作用研究[J]．皖南醫(yī)學院學報， 2007, 26(4):247-249．

[9] 湯耀卿，李 磊．膿毒癥動物模型制作方略及應(yīng)用[J]．中華實驗外科志， 2011, 23(12):1433-1434．

[10] 王海華，閔志雪，戚仁斌，等．iNOS-GC-cGMP信號活化參與了內(nèi)毒素血癥大鼠血管低反應(yīng)性的發(fā)生機制[J]．中國病理生理雜志， 2012, 27(6):1076-1081．

[11] 包鵬舉，戚仁斌，王海華，等．銀杏達莫注射液對高鉀血癥大鼠離體血管張力的影響[J]．中國病理生理雜志，2011, 22(1):52-55．

[12] 楊 睿，王東強，李志軍．盲腸結(jié)扎穿刺大鼠膿毒癥模型改良[J]．中外醫(yī)療, 2014, 33(5):37-39．

[13]BarbeiroHV,BarbeiroDF,DebbasV,etal.Purinenucleotidesreducesuperoxideproductionbynitricoxidesynthaseinamurinesepsismodel[J].BrazJMedBiolRes, 2009, 42(11):1050-1057．

[14] Sessler CN, Perry JC, Varney KL. Management of severe sepsis and septic shock[J]. Curr Opni Crit Caer, 2004, 10(5):354-363．

[15] 韓啟德，文允鎰．血管生物學[M]．第1版．北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1997:74-79．

[16] Tanaka Y, Koike K, Toro L. MaxiK channel roles in blood vessel relaxations induced by endothelium-derived relaxing factors and their molecular mechanisms[J]. J Smooth Muscle Res, 2004, 40(45):125-153．