盧 陽(yáng)， 趙光舉， 洪廣亮， 邱俏檬， 李 冬， 盧中秋△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心， 2 溫州市第三臨床學(xué)院風(fēng)濕免疫科，浙江 溫州 325000)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可進(jìn)一步發(fā)展為膿毒性休克及多器官功能障礙綜合征，病死率居高不下。在膿毒癥致病過(guò)程中，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)NF-κB的表達(dá)和活化水平，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度、持久及廣泛的活化，是導(dǎo)致循環(huán)衰竭和組織器官損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。辣椒素(capsaicin, CAP)具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素對(duì)NF-κB的表達(dá)和活化水平具有重要影響，提示其在膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷中可能極具應(yīng)用價(jià)值[2]。有鑒于此，本項(xiàng)目擬通過(guò)研究辣椒素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響和機(jī)制，為其在膿毒癥中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠45只，雄性，體重18～22 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞從小鼠主動(dòng)脈中分離獲取，連續(xù)傳至3代。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰蛋白酶購(gòu)自Gibco；LPS和CAP(以0.1% DMSO溶解后備用)購(gòu)自Sigma； von Willebrand 因子(von Willebrand factor, vWF)兔單克隆抗體、NF-κB p65兔多克隆抗體和TATA框結(jié)合蛋白(TATA-box-binding protein,TBP)兔多克隆抗體均由Abcam提供；p-IκBα和IκBα兔單克隆抗體由Cell Signaling Technology提供；β-actin兔多克隆抗體以及細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒均購(gòu)自中國(guó)南京Bioworld 生物公司；RIPA裂解液(強(qiáng))和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；可溶性細(xì)胞間黏附分子1 (soluble intercellular adhesion molecule 1,sICAM-1)、可溶性血管細(xì)胞黏附分子1(soluble vascular adhesion molecule 1, sVCAM-1)和可溶性P-選擇素 (soluble P-selectin, sP-selectin)ELISA試劑盒購(gòu)自R&D Systems，上海西唐生物科技有限公司進(jìn)口分裝。

3 方法

3.1血管內(nèi)皮細(xì)胞提取培養(yǎng)和鑒定 處死清潔級(jí)健康ICR小鼠，分離主動(dòng)脈并切成1.5 mm×1.5 mm小塊后放入不含膠原酶的6孔板，于貼壁4 h后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后去除組織塊，每2 d更換培養(yǎng)基，至細(xì)胞融合成單層鋪滿孔底90%以上進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代過(guò)程中以0.125%胰蛋白酶消化，2～3 min后，輕輕吹打，傳代至1%明膠預(yù)先處理的培養(yǎng)瓶，傳代分瓶比例為1∶2。內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用Ⅷ因子相關(guān)抗原(即vWF)免疫熒光檢測(cè)，陽(yáng)性信號(hào)為綠色熒光。

3.2分組及處理 取第3代內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板(5×107cells/L，1mL/well)培養(yǎng)12h后去除完全培養(yǎng)基，分為正常組、溶劑對(duì)照組、LPS組和LPS+CAP組。其中正常組只加完全培養(yǎng)基；溶劑對(duì)照組用與CAP等體積的0.1%DMSO刺激；LPS組用與CAP等體積的0.1%DMSO及100μg/LLPS刺激；LPS+CAP組用100μg/LLPS及不同濃度CAP(50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)同時(shí)刺激。分別于刺激后12h、24h和48h留取細(xì)胞及上清液備用。

3.3ELISA 取各組的細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)上清液中sICAM-1、sVCAM-1和sP-selectin，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

3.4核蛋白以及胞漿蛋白提取 1 000×g離心5min，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，吸取上清，加入預(yù)冷的細(xì)胞漿蛋白提取試劑A和蛋白酶抑制劑，高速漩渦振蕩15s，置冰上10min。加入預(yù)冷的細(xì)胞漿蛋白提取試劑B后再次高速漩渦振蕩5s，然后4 ℃、12 000×g離心10min，上清即為胞漿蛋白，吸去上清后在沉淀中加入預(yù)冷的細(xì)胞核蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑，高速漩渦振蕩15s，置冰上40min，每隔10min高速漩渦振蕩15s，4 ℃、12 000×g離心10min，將上清吸入另一離心管，即可得到核蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，-20 ℃保存。

3.5Western blotting 蛋白上樣前加5×上樣緩沖液并煮沸5 min，蛋白上樣量為40 μg；配制10%分離膠和4%濃縮膠(聚丙烯酰胺凝膠)；在濃縮膠中90 V，分離膠中110 V電泳；濕式電泳儀轉(zhuǎn)膜300 mA、60 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；Ⅰ抗和內(nèi)參照抗體4 ℃孵育16 h；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體室溫下孵育1 h；洗膜后ECL試劑盒顯色；曝光成像。Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度值分析，用同一目的蛋白與內(nèi)參照灰度比值得出此目的蛋白的相對(duì)含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

原代主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞單層排列，細(xì)胞邊界清楚，呈扁平短梭形或多角形，細(xì)胞團(tuán)塊中間較密，周邊細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形并游離向外生長(zhǎng)，細(xì)胞成鋪路石樣排列，見圖1A。vWF免疫熒光檢查：可見細(xì)胞質(zhì)激發(fā)出綠色熒光, 即呈陽(yáng)性反應(yīng),表明vWF存在，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，見圖1B。

2 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后sP-selectin水平的影響

與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組內(nèi)皮細(xì)胞的sP-selectin顯著升高(P<0.05)，且隨著時(shí)間的變化 sP-selectin逐漸升高，LPS可以時(shí)間依賴性地上調(diào) sP-selectin水平；與內(nèi)毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預(yù)組sP-selectin水平顯著降低(P<0.05)，且隨著辣椒素濃度增加，細(xì)胞上清液中sP-selectin逐漸降低，見表1。

Figure 1. Cultured endothelial cells of mouse aorta observed under microscope (A;×100) and identified by von Willebrand factor immunofluorescence staining (B;×200).

3 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后血管內(nèi)皮細(xì)胞sVCAM-1水平的影響

與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組內(nèi)皮細(xì)胞的sVCAM-1顯著升高(P<0.05)，且隨著時(shí)間的變化，sVCAM-1水平逐漸升高；與內(nèi)毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預(yù)組細(xì)胞上清液sVCAM-1含量顯著降低(P<0.05)，見表2。

表1 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后可溶性P-選擇素水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

表2 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后可溶性ICAM-1水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

4 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后血管內(nèi)皮細(xì)胞sICAM-1水平的影響

與對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組內(nèi)皮細(xì)胞的sICAM-1顯著升高(P<0.05)，且隨著時(shí)間的變化，sICAM-1的水平逐漸升高；與內(nèi)毒素組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預(yù)組細(xì)胞上清液sICAM-1含量顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后可溶性VCAM-1水平的影響

*P<0.05vsDMSO control;#P<0.05vsLPS.

5 辣椒素對(duì)內(nèi)毒素作用后血管內(nèi)皮細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白和胞漿p-IκBα、IκBα蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白和p-IκBα蛋白水平顯著升高(P<0.05)，LPS組胞漿IκBα蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L辣椒素干預(yù)組內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi)NF-κB p65和p-IκBα蛋白的表達(dá)均有下降，IκBα蛋白表達(dá)水平均有升高，其中100 μmol/L和200 μmol/L組顯著差異(P<0.05)，見圖2。

討 論

在膿毒癥致病過(guò)程中，炎癥介質(zhì)(LPS、TNF-α等)能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，表現(xiàn)為黏附分子P-選擇素、E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1等表達(dá)上調(diào)[3]。細(xì)胞表面的黏附分子脫落進(jìn)入血液循環(huán)或細(xì)胞上清中即稱為可溶性黏附分子。研究已經(jīng)證實(shí)，sP-選擇素、sVCAM-1及sICAM-1水平與血管內(nèi)皮細(xì)胞活化狀態(tài)密切相關(guān)，是細(xì)胞活化的重要標(biāo)志分子[4-5]。黏附分子的上調(diào)可促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成固定黏附，進(jìn)而遷移進(jìn)入組織并釋放大量促炎因子、蛋白酶等，進(jìn)一步加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞活化水平，最終導(dǎo)致組織器官損傷的發(fā)生[6]。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，LPS作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液中sP-selectin、sVCAM-1及sICAM-1水平顯著增加，其中sVCAM-1和sICAM-1水平與LPS作用時(shí)間密切相關(guān)。因此，積極評(píng)估血管內(nèi)皮細(xì)胞活化水平并對(duì)其進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于膿毒癥的治療無(wú)疑具有重要的價(jià)值。

辣椒素是辣椒中的主要辛辣部分，其通過(guò)結(jié)合辣椒素受體釋放多種神經(jīng)肽而具有抗炎、清除自由基、鎮(zhèn)痛、保護(hù)胃黏膜及抗腫瘤等的作用，而其在血管保護(hù)中的作用越發(fā)受到重視[7]。據(jù)報(bào)道，辣椒素能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面辣椒素受體結(jié)合，激活活化蛋白激酶A，增加內(nèi)皮一氧化氮合成酶的磷酸化和一氧化氮產(chǎn)生，從而改善血管舒張功能[8]。雖然有研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素單獨(dú)作用能夠促進(jìn)ECV304細(xì)胞中sICAM-1的表達(dá)[9]，然而其對(duì)炎癥狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素能夠劑量依賴性下調(diào)細(xì)胞上清液中sICAM-1、sVCAM-1和sP-selectin的水平，提示辣椒素對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞活化具有重要的抑制作用，但其最佳劑量仍有待進(jìn)一步闡明。

Figure 2. The effects of capsaicin (CAP) on the expression of nuclear NF-κB p65 and cytoplasmic p-IκBα and IκBα in the endothelial cells after lipopolysaccharide (LPS) stimulation for 24 h.N: normal; C: DMSO control; TBP: TATA-box-binding protein.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs C; #P<0.05 vs LPS.

眾多轉(zhuǎn)錄因子參與了感染狀態(tài)下宿主的反應(yīng)，包括NF-κB、ESE-1、AP-1、GATA-2及Erg-1等，其中NF-κB發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[10]。雖然已經(jīng)證實(shí)，轉(zhuǎn)染IκBα抑制NF-κB的活性能夠顯著提高膿毒癥小鼠的生存率，但其作為內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的干預(yù)靶點(diǎn)近年來(lái)才得到關(guān)注[11]。Ye等[12]發(fā)現(xiàn)，特異性阻斷內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB活化后，內(nèi)毒素血癥小鼠內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)減低，組織器官損傷程度和死亡率也明顯降低。一般而言，未活化的NF-κB以p65/p50的形式與IκBα存在于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)刺激發(fā)生后，IκBα發(fā)生磷酸化繼而泛素化降解，使p65/p50與IκBα分離并從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激24 h后細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65和胞漿內(nèi)的p-IκBα的表達(dá)水平明顯增高，但胞漿內(nèi)的IκBα表達(dá)水平顯著降低。辣椒素能夠明顯下調(diào)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65胞漿內(nèi)p-IκBα的水平，升高IκBα表達(dá)水平，提示辣椒素對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的抑制作用可能是通過(guò)阻斷NF-κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化是膿毒癥致病過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。辣椒素能夠有效抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞的活化水平，提示其在膿毒癥治療中可能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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