趙 莉， 姚樹桐， 陳 軍， 苗 成， 李嚴(yán)嚴(yán)， 田 華， 周 健， 翟 雷， 桑 慧， 王義圍△， 秦樹存△

(1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000； 泰山醫(yī)學(xué)院 2動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

作為心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)嚴(yán)重危害人類的健康，巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成是其重要病理學(xué)標(biāo)志，并在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1]。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein，ox-LDL)是誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的主要因素。由于巨噬細(xì)胞通過清道夫受體A1(scavengerreceptorA1，SR-A1)、CD36等清道夫受體對ox-LDL的攝取是無上限的，導(dǎo)致大量脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)蓄積使其變成泡沫細(xì)胞。同時由于氧化脂質(zhì)具有很強的細(xì)胞毒效應(yīng)，最終引起泡沫細(xì)胞凋亡、壞死，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)核心[2]。因此，由清道夫受體介導(dǎo)的對ox-LDL無限制攝取是泡沫細(xì)胞形成和AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，已成為AS治療的重要靶點。

高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，HDL)具有膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、抗炎、抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮等功能，是公認(rèn)的具有抗AS作用的“好膽固醇”[3]。但是在AS患者體內(nèi)HDL水平往往降低，尤其是HDL結(jié)構(gòu)和組成成分的改變使其抗AS作用喪失，甚至表現(xiàn)出促炎、促氧化等特性，成為AS發(fā)生發(fā)展的危險因素[4]。近年來研究表明HDL主要蛋白成分載脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,ApoA-I)的模擬肽L-4F和D-4F能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出[5]，抑制血脂紊亂所導(dǎo)致的小鼠AS[6]，但該模擬肽是否可通過調(diào)控清道夫受體表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積尚未見報道。本課題組最新研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)通過上調(diào)清道夫受體SR-A1和CD36表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成[7]，故本工作在ox-LDL和ERS誘導(dǎo)劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞模型和ERS模型上，研究ApoA-I模擬肽D-4F對SR-A1表達(dá)的影響，以探討其對巨噬源性泡沫細(xì)胞形成的調(diào)控作用及機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；D-4F(Ac-DWFKAFYDKVAEKFKEAF-NH2)和紊亂模擬肽(scrambled D-4F，sD-4F; Ac-DWFAKDYFKKAFVEEFAK-NH2)購自中科亞光多肽服務(wù)公司；ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清為Gibco產(chǎn)品；RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒為Solarbio產(chǎn)品；兔抗SR-A1和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)多克隆抗體購自Santa Cruz；4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)、TM和兔抗β-actin抗體購自Sigma；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和PVDF膜分別為Pierce和Millpore產(chǎn)品；Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品；cDNA合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自北京天根公司；組織/細(xì)胞總膽固醇(total cholesterol，TC)測定試劑盒和DiI-ox-LDL分別購自北京普利萊公司和北京協(xié)生生物公司；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L和鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞。處理前換含1%血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后給予不同濃度的D-4F(12.5、25和50 mg/L)、sD-4F(50 mmol/L)處理1 h或者5 mmol/L PBA處理30 min后，再加入ox-LDL(100 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)12 h。另外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞給予50 mg/L D-4F 或sD-4F 處理1 h，再加入2 mg/L TM處理4 h。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活性 將細(xì)胞以1×104/well接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞經(jīng)處理后，加入MTT(0.5g/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 4h。棄上清后每孔加 200μL二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，振蕩搖勻，用InfiniteF200型多功能酶標(biāo)儀(Tecan)在490nm處測定各孔吸光度(absorbance，A)。以對照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力以其A值占對照組A值的百分比表示。

2.3試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)TC的含量 按照組織/細(xì)胞TC測定試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)TC，并以細(xì)胞每克總蛋白中所含的TC量(μmol/g protein)來表示。

2.4Westernblotting檢測SR-A1和GRP78蛋白的表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)處理后，按照RIPA蛋白提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞蛋白，經(jīng)定量、變性處理并進(jìn)行SDS-PAGE(10%分離膠)分離后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后分別用兔抗SR-A1 (1∶300)、GRP78 (1∶400)和β-actin抗體(1∶800)室溫孵育3h，洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記相應(yīng)Ⅱ抗孵育2h。免疫條帶用ECL法顯示，暗室曝光，采用Image-ProPlus軟件分析蛋白條帶累積吸光度(integratedabsorbance，IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對水平。

2.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)技術(shù)檢測SR-A1 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑說明提取各組細(xì)胞總RNA。取RNA樣品1 μg，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA產(chǎn)物。按熒光實時定量PCR試劑盒說明書準(zhǔn)備20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green 9 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水5 μL。在熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q型，Qiagen)上反應(yīng)，條件為94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，40個循環(huán)。β-actin為內(nèi)參照，利用2-ΔΔCt公式計算目的基因mRNA的表達(dá)情況。SR-A1上游引物5’-GTTAAAGGTGATCGGGGACA-3’，下游引物5’-TCCCCTTCTCTCCCTTTTGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度118 bp；β-actin上游引物5’-CGGGGACCTGACTGACTACC-3’，下游引物5’- AGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度251 bp，由上海生工公司合成。

2.6DiI-ox-LDL攝取的分析 參照既往報道方法[7]操作，即給予巨噬細(xì)胞50mg/LD-4F或sD-4F處理1h，再加入2mg/LTM處理4h后，加入DiI-ox-LDL(50mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)4h，避光條件下以PBS潤洗3次，并以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA法蛋白定量。2 000r/min離心5min，將上清200μL加入96孔板，用多功能酶標(biāo)儀(InfiniteF200型，Tecan)檢測熒光強度(激發(fā)波長530nm，發(fā)射波長590nm)。將DiI-ox-LDL稀釋成0、5、10、15、20、25、50和100mg/L，相同條件下檢測熒光強度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。ox-LDL攝取量以mg/gprotein表示。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0 for Windows 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間均數(shù)比較用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 D-4F減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷

ox-LDL顯著誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷，其細(xì)胞活性較正常對照組降低43.7%(P<0.01)；與PBA相似，D-4F可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，細(xì)胞活性明顯增加且呈濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)；ox-LDL+sD-4F組與ox-LDL組比較細(xì)胞活性無顯著差異(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. D-4F (mg/L) inhibited ox-LDL-induced macrophage injury.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05, ##P<0.01 vs ox-LDL group.

2 D-4F減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積

細(xì)胞內(nèi)TC測定結(jié)果顯示，與正常對照組比較，ox-LDL組巨噬細(xì)胞內(nèi)TC含量顯著增加(P<0.01)，而D-4F(12.5、25和50 mg/L)明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，其TC含量分別為ox-LDL 組的69.9%、57.6%和53.4%(P<0.05或P<0.01)；PBA也可明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積(P<0.05),見圖2。

Figure 2. D-4F (mg/L) reduced ox-LDL-induced intracellular cholesterol accumulation in RAW264.7 cells. Mean±SD. n=6.*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs ox-LDL group.

3 D-4F對ox-LDL所誘導(dǎo)的SR-A1和GRP78蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，ox-LDL處理組細(xì)胞SR-A1和GRP78蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.01)，而D-4F同PBA相似，顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的SR-A1和GRP78蛋白上調(diào)，并且呈濃度依賴性(P<0.05),見圖3。

Figure 3. The effect of D-4F (mg/L) on ox-LDL-induced SR-A1 and GRP78 protein expression in RAW264.7 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs ox-LDL group.

4 D-4F對ox-LDL所誘導(dǎo)的SR-A1 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，ox-LDL明顯上調(diào)SR-A1 mRNA水平(P<0.01)，而D-4F顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的SR-A1 mRNA上調(diào)，且呈濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

5 D-4F對TM所誘導(dǎo)的SR-A1和GRP78表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組比較，TM可明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞SR-A1和GRP78蛋白水平(P<0.01)，而D-4F顯著抑制TM所誘導(dǎo)的SR-A1和GRP78蛋白表達(dá)，分別下降45.5%和42.1%(P<0.05)。

6 D-4F對TM所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ox-LDL攝取的影響

Dil-ox-LDL吞噬實驗結(jié)果(圖6)顯示，與對照組比較，TM明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞對Dil-ox-LDL的攝取(P<0.01)，而D-4F對TM所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ox-LDL攝取有明顯抑制作用，為TM組的62.9%(P<0.05)。

Figure 4. The effect of D-4F (mg/L) on ox-LDL-induced mRNA expression of SR-A1 in RAW264.7 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01 vs ox-LDL group.

Figure 5. The effect of D-4F on tunicamycin (TM)-induced SR-A1 and GRP78 expression in RAW264.7 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs TM group.

Figure 6. The effect of D-4F on tunicamycin (TM)-induced uptake of ox-LDL in RAW264.7 cells.Mean±SD.n=4. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs TM group.

討 論

HDL通過逆轉(zhuǎn)運膽固醇、抗脂質(zhì)氧化、抗炎、抗血栓形成、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等功能發(fā)揮其抗AS作用，但是近年研究發(fā)現(xiàn)HDL含量與其功能不成比例，在AS患者體內(nèi)HDL亞組分改變，如蛋白成分氧化修飾或糖基化修飾后其抗AS功能明顯降低，甚至表現(xiàn)出促炎、促氧化等促AS特性[4, 8]。ApoA-I是HDL的主要蛋白成分和功能執(zhí)行者，但由于其分子量大，制造起來非常困難并且昂貴。近年來運用生物技術(shù)開發(fā)研制的具有18個氨基酸肽鏈片段的ApoA-I模擬肽L-4F和D-4F能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出、增加前β-HDL的形成、減少脂蛋白氧化，使失功能HDL變成功能HDL，從而發(fā)揮抗AS功能[5-6,8]。本實驗結(jié)果顯示， D-4F可以顯著抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞損傷，并減輕細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積。

由清道夫受體介導(dǎo)的對ox-LDL無限制攝取是泡沫細(xì)胞形成和AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。SR-A1是巨噬細(xì)胞表面的糖蛋白，特異性識別并且結(jié)合ox-LDL，且其介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取不受細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)無限制蓄積，形成AS粥樣斑塊特征性標(biāo)志——泡沫細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生凋亡、壞死，導(dǎo)致易損斑塊形成，成為急性心血管事件的重要病理基礎(chǔ)[2，9]。利用siRNA干擾技術(shù)沉默SR-A表達(dá)可減少AS斑塊及泡沫細(xì)胞的形成，提示抑制SR-A介導(dǎo)的巨噬源性泡沫細(xì)胞形成可能是AS防治新的突破口[10]。本工作結(jié)果顯示，D-4F在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均明顯抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的SR-A1上調(diào)，且呈濃度依賴性，提示D-4F對巨噬細(xì)胞泡沫化和損傷的抑制作用與下調(diào)SR-A1表達(dá)有關(guān)。

近年來ERS在AS發(fā)生發(fā)展中的作用已受到廣泛關(guān)注，證實ERS在脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞凋亡等過程中起著重要作用，同時高同型半胱氨酸、高血糖等獨立的心血管危險因子也被證明可能通過誘導(dǎo)ERS而誘發(fā)AS[11]。研究報道軟脂酸酯可上調(diào)巨噬細(xì)胞ox-LDL受體1(ox-LDL receptor 1,LOX-1)表達(dá)，而沉默ERS關(guān)鍵信號分子肌醇需求激酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R樣ER激酶(PKR-like ER kinase，PERK)則明顯拮抗軟脂酸酯對LOX-1的誘導(dǎo)作用[12]。本課題組最近已證實沉默ERS另一關(guān)鍵信號分子活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)及其下游分子伴侶GRP78后可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[7, 13]，且ERS抑制劑PBA可抑制ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SR-A1上調(diào)，提示ERS通過上調(diào)清道夫受體表達(dá)介導(dǎo)ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化過程。本實驗結(jié)果顯示，與PBA相似，D-4F不僅可減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷和細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，而且抑制SR-A1和GRP78蛋白上調(diào)。本課題組和文獻(xiàn)既往報道ERS誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素和TM可上調(diào)巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36、SR-A1和LOX-1表達(dá)[7,12,14]的結(jié)果一致。為了進(jìn)一步證實D-4F是否通過調(diào)控ERS信號途徑減輕ox-LDL 所誘導(dǎo)的SR-A1上調(diào)，我們在TM所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞ERS模型上研究了D-4F對SR-A1表達(dá)和ox-LDL攝取的影響，結(jié)果顯示，D-4F可顯著抑制TM所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SR-A1和GRP78上調(diào)及對ox-LDL的吞噬，提示D-4F可能通過抑制ERS信號途徑減輕 SR-A1所介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取。

綜上所述，本研究通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)ApoA-I模擬肽D-4F可以通過抑制GRP78介導(dǎo)的ERS信號途徑減輕ox-LDL所誘導(dǎo)的清道夫受體SR-A1表達(dá)，從而減輕巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積和細(xì)胞損傷，發(fā)揮抗AS功能。CD36是巨噬細(xì)胞膜上介導(dǎo)ox-LDL攝取的另一重要清道夫受體，而ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的重要載體，D-4F是否也可通過調(diào)控上述受體表達(dá)進(jìn)而影響到巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積正在進(jìn)一步研究中。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Badimon L, Storey RF, Vilahur G. Update on lipids, inflammation and atherothrombosis[J]. Thromb Haemost, 2011, 105(Suppl 1):S34-S42.

[2]SeimonT,TabasI.Mechanismsandconsequencesofmacrophageapoptosisinatherosclerosis[J].JLipidRes, 2009, 50(Suppl):S382-S387.

[3] Farmer JA, Liao J. Evolving concepts of the role of high-density lipoprotein in protection from atherosclerosis[J]. Curr Atheroscler Rep, 2011, 13(2):107-114.

[4]TothPP,DavidsonMH.High-densitylipoproteins:markerofcardiovascularriskandtherapeutictarget[J].JClinLipidol, 2010, 4(5): 359-364.

[5] Xie Q, Zhao SP, Li F. D-4F, an apolipoprotein A-I mimetic peptide, promotes cholesterol efflux from macrophages via ATP-binding cassette transporter A1[J]. Tohoku J Exp Med, 2010, 220(3):223-228.

[6]QinS,KamannaVS,LaiJH,etal.ReverseD-4F,anapolipoprotein-AImimeticpeptide,inhibitsatherosclerosisinApoE-nullmice[J].JCardiovascPharmacolTher, 2012, 17(3): 334-343.

[7] Yao S, Miao C, Tian H, et al. Endoplasmic reticulum stress promotes macrophage-derived foam cell formation by up-regulating cluster of differentiation 36 (CD36) expression[J]. J Biol Chem, 2014, 289(7):4032-4042.

[8]ImaizumiS,NavabM,MorgantiniC,etal.Dysfunctionalhigh-densitylipoproteinandthepotentialofapolipoproteinA-Imimeticpeptidestonormalizethecompositionandfunctionoflipoproteins[J].CircJ, 2011, 75(7):1533-1538.

[9] Zhou F, Pan Y, Huang Z, et al.Visfatin induces cholesterol accumulation in macrophages through up-regulation of scavenger receptor-A and CD36[J]. Cell Stress Chaperones, 2013, 18(5):643-652.

[10]MakinenPI,LappalainenJP,HeinonenSE,etal.SilencingofeitherSR-AorCD36reducesatherosclerosisinhyperlipidaemicmiceandrevealsreciprocalupregulationofthesereceptors[J].CardiovascRes, 2010, 88(3):530-538.

[11] 姚樹桐, 秦樹存. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展和防治中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(2):364-368.

[12]IshiyamaJ,TaguchiR,AkasakaY,etal.UnsaturatedFAspreventpalmitate-inducedLOX-1inductionviainhibitionofERstressinmacrophages[J].JLipidRes, 2011, 52(2):299-307.

[13] Yao S, Zong C, Zhang Y, et al. Activating transcription factor 6 mediates oxidized LDL-induced cholesterol accumulation and apoptosis in macrophages by up-regulating CHOP expression[J]. J Atheroscler Thromb, 2013, 20(1):94-107.

[14]HuaY,KandadiMR,ZhuM,etal.Tauroursodeoxycholicacidattenuateslipidaccumulationinendoplasmicreticulum-stressedmacrophages[J].JCardiovascPharmacol, 2010, 55(1):49-55.