李軍+陳海燕+郭鴻雁+等

摘要：探討苦豆籽中生物堿提取的影響因素，并確定最佳的提取條件。通過單因素試驗和正交試驗，研究各種工藝條件（溶劑、料液比、提取時間、溶劑pH值）對苦豆籽生物堿提取率的影響，優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明：最佳提取條件為55%乙醇作為提取溶劑，料液比為1 g ∶16 mL，提取時間為3 h，溶劑pH值為3.5。研究的提取工藝簡便易行，并有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：苦豆籽；生物堿；提取

中圖分類號： Q946.88；R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0250-02

收稿日期：2013-09-12

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2011BA105B04）；寧夏高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（編號：NGY2012125）。

作者簡介：李軍（1982—），男，山西渾源人，碩士，講師，主要從事藥物提取方面的研究。E-mail：lijunamy@126.com?？喽棺樱⊿ophora alopecuroides L.）又稱苦甘草、苦豆根，隸屬于豆科槐屬，為多年生草本、根莖地下芽植物，其分布區(qū)較廣，在我國主產(chǎn)于寧夏、內(nèi)蒙古、山西、陜西、甘肅等地區(qū)[1-2]?？喽棺咽强喽棺拥某墒旆N子，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、植物生長調(diào)節(jié)劑、飼料業(yè)等領(lǐng)域[3]?？喽棺阎械纳飰A含量約為8.11%，主要含氧化苦參堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐果堿、槐定堿等20多種單一生物堿[4]。目前在臨床上應(yīng)用苦豆籽浸膏片、苦豆堿治療急性菌痢，用槐定堿和苦豆籽總堿注射液治療腫瘤的研究已經(jīng)進(jìn)行得較為成功。國內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于苦豆籽生物堿的報道主要集中在成分分析和檢測[5]，而以苦豆籽作為試驗材料并從中提取生物堿的報道很少，加上常規(guī)提取方法效率低、應(yīng)用局限性大，因此生產(chǎn)應(yīng)用價值不高[6]。本研究采用回流提取技術(shù)，通過正交試驗法對影響生物堿提取率的因素進(jìn)行優(yōu)化并選出最佳工藝條件，以期為今后從苦豆籽中獲得生物堿的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)與參考。

1材料與方法

1.1儀器與材料

所用的儀器主要有：TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；AE240電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DKB-8A 電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；130-A 型高速粉碎機(jī)，長沙市中南制藥機(jī)械廠。

材料與試劑主要有：苦豆籽，采于鹽池縣花馬池鎮(zhèn)德勝墩自然村等地，經(jīng)寧夏藥品檢驗所邢世瑞主任藥師鑒定為豆科槐屬植物苦豆子種子，粉碎過20目篩待用；乙醇、氯仿等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1苦豆籽生物堿含量的測定 苦豆籽總生物堿中含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，因此參考相關(guān)文獻(xiàn)，以槐定堿為指標(biāo)成分，采用溴麝香草酚藍(lán)比色法測定苦豆籽總生物堿含量（λ=410 nm）[7]，具體方法如下。

1.2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精確稱取5.00 mg槐定堿對照品置于5 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解、稀釋并定容，搖勻即得槐定堿對照液。分別取0、20、40、60、80、100、120、140 μL上述溶液于50 mL的磨口錐形瓶中，使乙醇揮發(fā)后分別加入12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍(lán)緩沖液、12 mL氯仿，密塞劇烈振搖2 min后靜置2 h，分取氯仿層，以第1組為空白對照，于410 nm處測定提取液的吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)、氯仿層濃度為縱坐標(biāo)得回歸方程：C=76.92D+0.77，r=0999 0。

1.2.1.2樣品含量的測定分別吸取1 mL定容的提取液并稀釋至100 mL，再吸取1 mL稀釋液至錐形瓶中，分別加入 12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍(lán)緩沖液、12 mL氯仿，密塞振搖2 min后注入酸式滴定管中，靜置2 h，分取氯仿層。以 1 mL 對應(yīng)的提取溶劑、12 mL pH值為7.6的溴麝香草酚藍(lán)緩沖液、12 mL氯仿進(jìn)行同比操作，設(shè)為空白對照，于410 nm處測定提取液的吸光度D，從制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的生物堿濃度，計算出苦豆籽總生物堿的含量。

1.2.2最佳提取溶劑的確定準(zhǔn)確稱取3份苦豆籽粉，每份25.0 g，在其他條件相同的情況下，分別用200 mL水、0.4%鹽酸、65%乙醇各進(jìn)行回流提取6 h，過濾后收集濾液并定容至200 mL，用溴麝香草酚藍(lán)比色法測定生物堿含量并計算生物堿提取率，確定最佳的提取溶劑。

1.3單因素試驗

1.3.1料液比分別準(zhǔn)確稱取4份25.0 g的苦豆籽粉并置于三角瓶中，再分別加入100、200、400、800 mL 65%乙醇，浸泡過夜后將其移至燒瓶中進(jìn)行回流提取6 h，過濾、定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2提取時間準(zhǔn)確稱取5份25.0 g苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，分別各加入200 mL 65%乙醇，浸泡過夜后將其移至燒瓶中分別回流提取2、4、6、8、10 h，過濾，定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3溶劑pH值準(zhǔn)確稱取5份25.0 g的苦豆籽粉，分別置于三角瓶中，分別加入pH值分別為1、2、3、4、5的65%乙醇200 mL，浸泡過夜后，將其移至燒瓶中分別回流提取6 h，過濾，定容作為提取液。按照“1.2.1”中苦豆籽生物堿含量測定方法測得生物堿提取率。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4正交試驗設(shè)計

準(zhǔn)確稱取9份苦豆籽粉，每份25.0 g，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以料液比、溶劑濃度、溶劑pH值、提取時間這4個因素做正交試驗，設(shè)計L9（34）正交試驗。根據(jù)試驗結(jié)果確定最佳的提取條件。endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達(dá)到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進(jìn)行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進(jìn)行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)

計，對結(jié)果進(jìn)行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復(fù)提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進(jìn)行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進(jìn)一步放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預(yù)試驗中考察了用65%乙醇進(jìn)行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達(dá)4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設(shè)備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設(shè)備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復(fù)性較好[9-10]。

參考文獻(xiàn)：

[1]李春英，胡永強(qiáng). 苦豆子中生物堿的分布及其在生長期內(nèi)的含量變化[J]. 植物生理學(xué)通訊，2009，45（9）：910-912.

[2]Haug G，Hoffmann H. Chemistry of plant protection[M]. Berlin：Springer Verlag，1986.

[3]秦學(xué)功，元英進(jìn). 苦豆子生物堿的研究與苦豆子綜合利用[J]. 中國野生植物資源，2000，19（4）：30-32.

[4]史高峰，張梅，陳學(xué)福，等. 正交實驗法優(yōu)選苦豆籽總生物堿的純化工藝[J]. 應(yīng)用化工，2011，40（10）：1774-1778.

[5]楊巧麗，顧政一，黃華. 中藥苦豆子的研究進(jìn)展[J]. 西北藥學(xué)雜志，2011，26（3）：232-236.

[6]賈曉紅，尚軍，余永婷，等. 苦豆籽中苦參堿的提取條件的優(yōu)化選擇[J]. 食品科技，2005（4）：39-42.

[7]李軍，冷曉紅，郝彩琴. 苦豆草生物堿提取方法的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（17）：47-48.

[8]李曉，魏悅，郭唯，等. 連翹葉中連翹苷的提取工藝[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2013，24（4）：843-844.

[9]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 正交試驗優(yōu)化云南松松針中莽草酸的提取工藝[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（10）：761-763.

[10]王豐，明哲. 菊芋花色素苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：250-251.陳華，廖崇靜，馮珊，等. 酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：252-254.endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達(dá)到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進(jìn)行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進(jìn)行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)

計，對結(jié)果進(jìn)行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復(fù)提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進(jìn)行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進(jìn)一步放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預(yù)試驗中考察了用65%乙醇進(jìn)行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達(dá)4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設(shè)備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設(shè)備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復(fù)性較好[9-10]。

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[7]李軍，冷曉紅，郝彩琴. 苦豆草生物堿提取方法的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2010，16（17）：47-48.

[8]李曉，魏悅，郭唯，等. 連翹葉中連翹苷的提取工藝[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2013，24（4）：843-844.

[9]張志琴，劉光明，楊永壽，等. 正交試驗優(yōu)化云南松松針中莽草酸的提取工藝[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（10）：761-763.

[10]王豐，明哲. 菊芋花色素苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：250-251.陳華，廖崇靜，馮珊，等. 酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：252-254.endprint

2結(jié)果與分析

2.1最佳提取溶劑的確定

提取溶劑對苦豆籽生物堿提取率的影響見表1，可以看出65%乙醇作為溶劑的提取率較高，達(dá)到3.43%，因此選65%乙醇作為溶劑進(jìn)行回流提取，選擇55%、65%、75%作為正交試驗的3個溶劑濃度。

最佳提取溶劑的確定

溶劑提取率（%）水2.630.4% 鹽酸2.8165% 乙醇3.43

2.2料液比對苦豆籽生物堿提取的影響

料液比對苦豆籽生物堿提取率的影響見圖1，可以看出，提取率隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶16 mL時，苦豆籽中的生物堿基本溶出，隨著溶劑用量的進(jìn)一步增加，提取率反而會明顯下降。因此選擇料液比1 g ∶16 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶24 mL作為正交試驗的3個考察水平。

2.3提取時間對苦豆籽生物堿提取的影響

隨著提取時間的增加，提取率逐漸增加，其中4 h的提取率最高，而后漸漸降低，綜合考慮提取率和效率，選擇3、4、5 h 3個水平進(jìn)行正交試驗。

2.4溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響

溶劑pH值對苦豆籽生物堿提取的影響結(jié)果見圖3，可以看出，苦豆籽生物堿的提取率隨著溶劑pH值的增加有一定的提高，pH值為4時的提取率最高，而后隨著pH值增加，提取率下降。因此選擇pH值3.5、4.0、4. 5作為正交試驗的3個考察水平。

2.5正交試驗結(jié)果

根據(jù)所選取的因素水平，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗設(shè)

計，對結(jié)果進(jìn)行極差分析試驗結(jié)果表明：4個因素對提取率的影響主次順序為A>D>C>B。得出最佳的提取工藝條件是：A1B3C1D1，其中最優(yōu)的B因素為75%乙醇，但考慮工業(yè)化生產(chǎn)中的安全性及成本，選擇最優(yōu)工藝條件為：A1B1C1D1，即55%乙醇，料液比1 g ∶16 mL，溶劑pH值=35，提取時間3 h。

2.6驗證性試驗

按照以上正交試驗所確定的最佳提取工藝重復(fù)提取3次，計算提取率，結(jié)果分別為4.57 %、4.61 %、4.58 %，均大于表3中的提取率，表明以上正交試驗所確定的提取工藝為最佳提取工藝。

3結(jié)論與討論

對苦豆籽生物堿進(jìn)行吸收波長掃描發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長為410 nm。采用單因素試驗和正交試驗法確定了最佳的提取條件為：料液比1 g ∶16 mL，提取溶劑為55%乙醇，溶劑pH值為3.5，提取時間3 h。工藝驗證試驗表明，最佳工藝的提取得率高、穩(wěn)定性好，且工藝操作容易控制，為進(jìn)一步放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供了條件[8]。

筆者在預(yù)試驗中考察了用65%乙醇進(jìn)行超聲、回流、煎煮提取，結(jié)果顯示超聲和回流提取法較煎煮法提取效率高，且超聲提取的提取率最高達(dá)4.7%，但是由于超聲提取法在工業(yè)生產(chǎn)中設(shè)備較少且較貴，目前較少有工業(yè)化的超聲提取設(shè)備，大部分企業(yè)以回流提取為主，故本研究最終確定用回流法提取總生物堿為考察指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，篩選得到的工藝條件經(jīng)驗證表明方法可行、重復(fù)性較好[9-10]。

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[10]王豐，明哲. 菊芋花色素苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：250-251.陳華，廖崇靜，馮珊，等. 酸堿處理提取水稻秸稈纖維素的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：252-254.endprint