盧勁曄+劉靜+盧煒+等

摘要：選取18只青年波雜山羊隨機分成高能量組與低能量組，在細胞和分子水平闡述瘤胃上皮增殖及其機理。結果顯示：高能量日糧提高山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表達，加速細胞周期G1期進程，促進細胞增殖，加快瘤胃乳頭生長，揭示了高能量日糧促進瘤胃乳頭生長的細胞生物學機制。

關鍵詞：高能量日糧；山羊；瘤胃上皮；細胞周期；Cyclin D1

中圖分類號： S827.5文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0145-04

收稿日期：2013-09-18

資助項目：國家自然科學基金（編號：30771568）；國家“973”計劃（編號：2011CB100801）

作者簡介：盧勁曄（1983—），男，江蘇揚州人，博士，講師，主要從事動物營養(yǎng)生理研究。Tel：（0523）86853000；E-mail：leopardleo@163.com。

通信作者：沈贊明，從事動物營養(yǎng)生理研究。E-mail：zmshen@njau.edu.cn。瘤胃是反芻動物消化代謝、營養(yǎng)吸收最重要的場所之一，瘤胃上皮吸收動物消化產生的能量、營養(yǎng)物質，瘤胃上皮的生長發(fā)育情況直接影響反芻動物的生產性能。提高動物日糧能量水平可以促進山羊瘤胃上皮生長及山羊個體生長[1]。哺乳動物體細胞數量增多是通過加快細胞的有絲分裂來完成的，細胞從一次有絲分裂結束開始到下一次有絲分裂完成所經歷的整個有序過程稱為細胞周期。細胞周期運行主要受細胞周期蛋白（cyclin）及細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調控，細胞周期蛋白表達水平直接影響細胞有絲分裂的速率[2]。本研究探討高能量日糧對山羊瘤胃上皮細胞周期以及CDK的影響，旨在為提高山羊生產性能提供依據。

1材料與方法

1.1材料

選用18只青年波雜山羊（波爾山羊×淮南羊雜交山羊，平均日齡為90 d）作為試驗對象。試驗開始前，對山羊進行驅蟲，山羊自由飲水，采食花生稈，逐漸添加精料至400 g/d，適應期30 d。試驗正式開始后，根據體重相近原則，將山羊隨機分為高能量組（ME：1.00 MJ/（kg0.75·d），約為維持水平的2.0倍）及低能量組（ME：0.60 MJ/（kg0.75·d），約為維持水平的1.2倍），高能量組及低能量組各9只山羊。所有山羊均單圈飼養(yǎng)，自由飲水，采食花生稈，日糧營養(yǎng)組成見表1。高能量組山羊每天08：00、11：00、14：00、17：00分別飼喂1次100 g精料（精料組成見表1），持續(xù)飼喂42 d，第43天屠宰取樣。

1.2主要試劑

碘化丙啶（Sigma公司），RNA酶抑制劑、隨機引物、dNTP（Promega公司），RevertAid M-MuLV反轉錄試劑盒、Taq DNA

山羊日糧的組成成分

日糧干物質

（%）干基營養(yǎng)成分含量（%）粗蛋白質粗脂肪粗纖維粗灰分干物質代謝能

（MJ/kg）飼料87.7523.804.157.608.8110.85花生稈89.818.152.2531.467.136.96注：精料由玉米、豆粕、棉籽、麩皮、魚粉、磷酸鈣、微量元素、維生素組成。

聚合酶試劑盒（Fermentas公司），引物設計與合成（Invitrogen公司），iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司），蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒（北京博邁德科技發(fā)展有限公司），ECL化學發(fā)光檢測試劑盒（Pierce公司），PVDF膜（Millipore公司），兔抗Cyclin D1多克隆抗體、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Bioworld公司），鼠抗CDK4單克隆抗體（Abcam公司）。

1.3流式細胞術測定山羊瘤胃上皮細胞周期

1.3.1瘤胃上皮細胞的分離與固定取約300 mg組織塊，用D-Hanks溶液（pH值為7.4，4倍雙抗，37 ℃水浴預溫）漂洗2～3次后，加0.25%胰酶15 mL，37 ℃水浴，30 min后棄去消化液，取出瘤胃上皮組織，重復3次上述步驟。在處理后的上皮組織中加D-Hanks溶液（pH值為7.4）清洗2次，繼續(xù)加入胰酶15 mL消化10 min，1 500 r/min離心10 min，收集細胞。用PBS緩沖液（pH值為7.4）洗滌細胞沉淀2次，2 mL預冷75%乙醇重懸細胞，混勻后4 ℃保存待測。

1.3.2碘化丙啶（PI）染色與流式細胞儀檢測將用75%乙醇固定的細胞用PBS緩沖液（pH值為7.4）洗滌2次以除去乙醇，再用50 μL PBS緩沖液（pH值為7.4）重懸，加入 500 μL PI染液，振蕩混勻，室溫避光染色15 min，用流式細胞儀檢測，每個樣品計數10 000個細胞，用CellQuest軟件測定細胞大小及細胞DNA含量等數據。

1.4RT-PCR法檢測山羊瘤胃上皮細胞周期蛋白、蛋白激酶mRNA

1.4.1樣品總RNA提取取約100 mg瘤胃上皮組織，用手持電動勻漿機徹底勻漿后采用異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取瘤胃上皮總RNA。用微量核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度及純度，所有樣品RNA的D260 nm/D280 nm比值均為1.8～2.0。用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的質量，樣品條帶清晰，無拖尾現象，且28 S與18 S條帶灰度之比約等于2.0，表明RNA無降解、質量可靠。調整RNA濃度為 1 μg/μL，-80 ℃保存。

1.4.2反轉錄（RT）用隨機引物同時對所有樣品的RNA進行反轉錄，得到各樣品的cDNA。反應總體積為25 μL，包括2 μg RNA、0.8 mmol/L dNTP、10 μmol/L隨機引物、5 U RNA酶抑制劑、100 U M-MLV反轉錄酶。先加RNA模板、dNTP、隨機引物，70 ℃變性5 min，使引物及模板配對。變性后立即置于冰上冷卻，再加入RNA酶抑制劑、M-MLV反轉錄酶，37 ℃反應60 min，95 ℃滅活5 min，將RT產物置于 -20 ℃ 冰箱中保存。

1.4.3PCR引物設計根據GenBank上牛的基因引物序列，用Primer 5.0軟件設計PCR引物（表2）。表2PCR擴增引物參數

基因引物序列來源大小

（bp）退火溫度

（℃）18S rRNA正向：5′-CGGACATCTAAGGGCATCA-3′；反向：5′-AAGACGGACCAGAGCGAAA-3′DQ222453.153858Cyclin D1正向：5′-CCTGCCGTCCATGCGGAA-3′；反向：5′-GAACTTCACATCTGTGGCAC-3′NM_001046273.143060Cyclin A正向：5′-ACAGTATGAGGGCTATCC-3′；反向：5′-TGTGGTGCTCTGAGGTAG-3′NM_001075123.158658CDK2正向：5′-GCTTTCTGCCACTCTCAT-3′；反向：5′-GCTCCGTCCATCTTCATC-3′NM_001014934.143858CDK4正向：5′-CGTTGGCTGTATCTTTGC-3′；反向：5′-GATTCGCTTGTGTGGGTT-3′NM_001037594.125658CDK6正向：5′-GCAGTATGAGTGCGTGG-3′；反向：5′-TTATGGTTTCAGTGGGC-3′XM_58915133552

1.4.4PCR擴增將所有待測RT產物的等比例混合樣對反應條件及循環(huán)圈數進行優(yōu)化。PCR反應體積為25 μL，包括2 μL上、下游引物（其中18S rRNA引物為0.12 μmol/L，其他目的基因引物為0.6 μmol/L），2 μL RT產物，0.1 μL（1 U）Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×Buffer（含100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl、1.0% Triton X-100），0.8 μL 0.32 mmol/L dNTP，1.8 μL MgCl2。PCR反應條件為： 94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，52～60 ℃復性35 s，72 ℃延伸40 s，重復32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。同時用ddH2O、RNA樣品分別取代RT產物作為對照，以檢驗是否有外源性、基因組DNA污染。

1.4.5電泳及結果分析PCR反應結束后，取18 μL PCR產物與2 μL 10 ×上樣Buffer混勻后上樣于2%瓊脂糖凝膠中（含0.1 μg/mL溴化乙錠）。在1×TAE電泳緩沖液中100 V電壓下電泳30 min，采用Marker DL2000同時電泳作為DNA標準分子量，采用Kodak 1D圖像分析系統(tǒng)觀察并分析結果。

1.5Real-time Q-PCR法檢測山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4 mRNA表達

以18S rRNA為內標基因，用熒光實時定量PCR（Real-time Q-PCR）進行相對定量。根據GenBank上的牛的基因引物序列，應用Primer 5.0軟件設計引物。Cyclin D1基因編號為EU525165.1，正向：5′-TTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向：5′-CCACCACCCTGTTACTGTT-3′。CDK4基因編號為NM_001127269.1，正向：5′-TGAGCATCCCAGTGTTGT-3′，反向：5′-CCTTGTCCAGATACTTCCT-3′。18S rRNA基因編號為DQ222453，正向：5′-GAAACGGCTACCACATCC-3′，反向：5′-ACCAGACTTGCCCTCC-3′。反應體積20 μL，包括 2 μL RT產物，2 μL上、下游引物，1× iQ SYBR Green supermix。用所有待測RT產物的混合樣（每份待測樣品等體積混合）對反應條件進行優(yōu)化。反應條件為：95 ℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，重復40個循環(huán)。通過熔點曲線判斷是否有非特異性擴增產物或引物二聚體出現，單一產物的熔點曲線只有1個單一峰，沒有雜峰，也不出現主峰的異常增寬。采用2-ΔΔCt法分析數據。ΔΔCt計算公式如下。

1.6Western Blot檢測山羊瘤胃上皮Cyclin D1、CDK4含量

1.6.1樣品蛋白的提取參照試劑盒說明書提取瘤胃上皮組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.6.2變性電泳取50 μg蛋白樣品與6×SDS上樣緩沖液按5 ∶1（體積比）混合均勻，100 ℃煮沸5 min，自然冷卻后加樣，5%濃縮膠、10%分離膠分別在80、100 V恒壓下電泳至溴酚藍前沿移動至凝膠底部。

1.6.3轉印電泳結束后，將凝膠上的蛋白用半干轉印儀轉印到PVDF膜上，轉印條件為電流1 mA/cm2，反應時間為40 min。

1.6.4封閉、抗體孵育轉印完畢后，取出PVDF膜，置于含有5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2 h。封閉完成后用TBST清洗PVDF膜上多余的奶粉，一抗（Cyclin D1和CDK4 1 ∶1 000 TBST稀釋，GAPDH 1 ∶5 000 TBST稀釋）中4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌后，繼續(xù)在二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG，1 ∶6 000 TBST稀釋）中室溫孵育1 h。

1.6.5發(fā)光、照相TBST充分洗滌后加入化學發(fā)光液，暗室曝光、顯影、定影，在膠片上獲得相應的蛋白條帶。

1.7數據處理

用Kodak 1D凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進行光密度測定，以目的條帶與GAPDH條帶的光密度比值代表目的條帶表達的相對水平。結果以平均數±標準誤表示。采用SPSS 13.0軟件分析數據。

2結果與分析

2.1日糧能量水平對山羊瘤胃上皮細胞周期的影響HL組山羊瘤胃上皮細胞S期、G2/M期細胞百分率均顯著高于LL組，G0/G1期細胞百分率顯著低于LL組。由此可知，高能量日糧能加速山羊瘤胃上皮細胞周期G1期進程，促進細胞增殖。

日糧能量水平對山羊瘤胃上皮細胞周期的影響

組別細胞百分率（%）G0/G1期S期G2/M期低能量組（LL）89.19±1.319.09±1.441.72±0.39高能量組（HL）81.16±1.24*14.96±1.33*3.87±0.65*注：“*”表示與LL組相比差異顯著，各期細胞百分率測定以檢測10 000個細胞為基準。

2.2細胞周期蛋白和蛋白激酶基因在山羊瘤胃上皮的表達

Cyclin D1、Cyclin A、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA 在山羊瘤胃上皮均有表達。

2.3日糧能量水平對山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA和蛋白表達的影響

HL組山羊瘤胃上皮Cyclin D1 mRNA表達水平顯著高于LL組。由圖3可知，Western Blot法檢測出 Cyclin D1蛋白在山羊瘤胃上皮均有表達。HL組山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表達水平顯著高于LL組。由此可知，高能量日糧能促進山羊瘤胃上皮G1期細胞周期調節(jié)蛋白Cyclin D1蛋白表達。

2.4日糧能量水平對山羊瘤胃上皮CDK4 mRNA、蛋白表達的影響

CDK4 mRNA表達水平在HL組與LL組之間差異不顯著。由圖5可知，Western Blot法檢測出CDK4蛋白在山羊瘤胃上皮表達。HL組山羊瘤胃上皮CDK4蛋白表達水平顯著高于LL組。由此可知，高能量日糧通過促進山羊瘤胃上皮Cyclin D1-CDK4復合物形成，推動G1期細胞進入S期。

3結論與討論

高能量飼料能促進青年奶牛瘤胃乳頭生長[3-4]。Stobo等研究表明，與粗料相比，高能量精料能促進犢牛體重增加，提高瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度，刺激瘤胃上皮乳頭增大[5]。研究表明，高能量日糧能促進多種反芻動物，包括山羊、綿羊、牛的瘤胃上皮乳頭生長[6-9]。測定動物機體及其器官生長最經典的表觀指標是質量。器官質量的改變可通過細胞數量性增生或細胞肥大完成。細胞從一次有絲分裂結束開始到下一次有絲分裂完成所經歷的整個有序過程稱為細胞周期。完成1次細胞周期后，1個母細胞分裂為2個子細胞。細胞周期由G1期（生長期，DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有絲分裂期）多個環(huán)節(jié)組成。本研究發(fā)現，高能量日糧山羊瘤胃上皮細胞G1期細胞百分率降低，S期、G2/M期細胞百分率升高，說明高能量日糧能加速山羊瘤胃上皮細胞G1期進程，推動細胞從G1期進入S期、G2/M期，從而加速細胞周期運轉，促進細胞增殖。細胞周期進程受到細胞周期蛋白（Cyclins）、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）復合物的調節(jié)。每種Cyclin與相應CDK裝配形成具有全酶活性Cyclin-CDK復合物，通過底物磷酸化作用確保細胞周期各個階段順利運行。Cyclin D-CDK4/6復合物、Cyclin E-CDK2復合物調節(jié)細胞周期G1期的進程[10]。Cyclin A-CDK2復合物調節(jié)細胞周期S期進程，之后由Cyclin B-CDK1（cdc2）復合物推動G2期、M期運行。本研究表明，Cyclin D1、CDK4 的mRNA及蛋白在山羊瘤胃上皮中均有表達，高能量日糧條件下山羊瘤胃上皮細胞細胞周期G1期進程加快與G1期細胞周期蛋白Cyclin D1及CDK4表達升高有關。Cyclin D1從G1早期開始合成，持續(xù)合成并累積至G1中期，與CDK4、CDK6形成Cyclin D1-CDK4/6復合物。G0期、G1早期的Rb蛋白處于低磷酸化水平，Cyclin D1-CDK4復合物磷酸化Rb蛋白的S795位點，釋放E2F轉錄因子[11]。G1晚期在Cyclin E-CDK2參與下，Rb蛋白多個位點（S780、S795、S807、S811）高度磷酸化，釋放全部E2F轉錄因子[12-13]，活化的E2F啟動下游細胞周期的進程關鍵基因轉錄[14]，從而使細胞周期從G1期順利進入S期。哺乳動物細胞中G1期細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E的合成受到多種外界因素的調節(jié)，日糧能量水平是其中最重要的因素之一。提高日糧能量水平能促進小鼠體重增加、提高復層上皮細胞及肝臟上皮細胞Cyclin D1表達[15]。Kobayashi等給大鼠飼喂不同能量水平日糧，高能量組大鼠前列腺上皮Cyclin D1表達較低能量組顯著升高、細胞增殖加快[16]。限制大鼠的日糧能量攝入后，大鼠乳腺上皮細胞Cyclin D1蛋白表達水平下降，其下降幅度與日糧能量降低幅度呈正相關[17]。研究發(fā)現，早期肝臟上皮細胞的異常增生、癌變與攝入大量高能量食物有關，飼喂高能量日糧能提高大鼠肝臟上皮細胞Cyclin D1表達，導致細胞增殖加快[18]。研究表明，Cyclin D1、Cyclin E表達升高均能導致細胞周期G1期進程加快。Resnitzky運用轉基因技術使大鼠成纖維細胞Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E蛋白過表達，結果發(fā)現，Cyclin D1、Cyclin E蛋白過表達的未同步化的體外培養(yǎng)大鼠成纖維細胞G1期進程均較對照組顯著加快，Cyclin B1過表達則對細胞周期進程無影響，表現為Cyclin D1組、Cyclin E組較對照組G1期細胞百分率降低，S期、G2/M期細胞百分率升高；Cyclin B1組與對照組G1期、S期、G2/M期細胞百分率均無顯著差異[19]。研究發(fā)現，Cyclin D1異位過表達的大鼠肝臟上皮細胞較正常表達組G1期時間縮短，細胞體積變小[20-21]。研究人員體外用鋅處理停滯在G1期的人乳腺上皮細胞，提高Cyclin D1蛋白表達，15 h后33%～38%的細胞進入S期，相反，當Cyclin D1蛋白表達水平下降時，Cyclin D1-CDK4復合物活化水平降低，細胞周期停滯在G1期。據報道，體外添加SJSZ糖蛋白能抑制肝臟上皮細胞Cyclin D1表達，同時提高細胞周期蛋白激酶抑制蛋白（CDK inhibitor，CKI）p53、p21、p27蛋白表達，抑制Cyclin D1-CDK4活化，進而使其細胞周期停滯在G1期[22]。高能量日糧對大鼠細胞周期的影響也主要作用在G1期[23]。細胞周期G1期的調節(jié)由Cyclin D1-CDK4復合物與Cyclin E-CDK2復合物共同完成，但是Cyclin D1-CDK4復合物合成要先于Cyclin E-CDK2復合物。研究發(fā)現，Cyclin E的表達依賴于Cyclin D1-CDK4復合物的活化，并且Cyclin D1表達促進Cyclin E的合成。

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