汪磊

摘 要：以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%，殘總糖≤1.0%，糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

關(guān)鍵詞：木薯清液；檸檬酸；黑曲霉

玉米清液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸已經(jīng)被全國不少廠家所使用，該工藝克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，為農(nóng)副產(chǎn)品深加工找到了一條出路，但是對玉米需求量的增大會使全球糧食危機(jī)加重。木薯產(chǎn)量高，不與主要糧食爭地，價格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生產(chǎn)檸檬酸的理想替代物，采用清液發(fā)酵具有發(fā)酵液固形物少，濾液清，油脂少，利于檸檬酸后提取，提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量等特點(diǎn)。且液化后得到的濾渣可用于制備高品質(zhì)的蛋白飼料。目前全國已有不少工廠以木薯粉為原料生產(chǎn)檸檬酸，文章進(jìn)行了以木薯清液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵的工藝研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中糧安徽生物化學(xué)有限公司菌種室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：采用土豆瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充2%的玉米漿作為氮源。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充適量尿素作為氮源。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面33℃，培養(yǎng)5～7d。種子罐采用5L單層平葉全自動發(fā)酵罐36℃培養(yǎng)20～24h，風(fēng)量1：0.4vvm，轉(zhuǎn)速300rpm，接入106個/ml的孢子。發(fā)酵罐采用50L三層平葉全自動發(fā)酵罐，裝液量30L，風(fēng)量1：0.2vvm，轉(zhuǎn)速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制備

按25%（m/v）的粉漿比對木薯粉進(jìn)行調(diào)漿，按50U/g絕干淀粉的量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃液化至碘試合格，離心取清液。

1.5 分析方法

pH測定：采用pH計測定。

產(chǎn)酸測定：發(fā)酵液經(jīng)普通濾紙過濾后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH為1%酸度。

總糖測定：經(jīng)6mol/L硫酸水解后，用費(fèi)林法測定[1]。

還原糖測定：直接用費(fèi)林法測定[1]。

蛋白質(zhì)測定：用凱氏定氮法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

檸檬酸發(fā)酵接種量的多少，直接決定于進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量[3]。菌絲球接種數(shù)一般與孢子數(shù)成正比。從表1中可以看出，菌絲球接種量大小對產(chǎn)酸率有一定的影響，在一定的范圍內(nèi)，接種量越大，產(chǎn)酸越高。但接種量過大會影響發(fā)酵的有效體積，本實(shí)驗(yàn)條件下，接種量在10～12%較為合適。

表1 接種量對產(chǎn)酸的影響

2.2 起始pH對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

接種量10%，考察不同起始pH對玉米清液發(fā)酵的影響。從表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0較為合適。起始pH較低（4.5以下），可能會影響糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值為大于5.5時，可能由于接近中性的條件下，細(xì)胞表面電荷減少，菌體間的斥力減弱而使菌球聚集，致使發(fā)酵產(chǎn)酸很慢[4]。

表2 起始pH對產(chǎn)酸的影響

2.3 發(fā)酵溫度控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

從表3可以看出，溫度低于35℃高于39℃時，菌體產(chǎn)酸水平較低。菌體最佳發(fā)酵溫度為37～39℃。溫度低于35℃時可能影響菌體生長從而導(dǎo)致產(chǎn)酸緩慢，發(fā)酵周期較長。溫度高于39℃時，發(fā)酵周期雖然縮短，但轉(zhuǎn)化率偏低，可能由于溫度過高導(dǎo)致菌體及雜酸產(chǎn)生過量，菌體易早衰，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。

表3 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸的影響

2.4 罐壓控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

發(fā)酵罐通風(fēng)時還要維持一定的罐壓，在一定范圍內(nèi)，氣體的溶解度與罐壓成正比。從表4可以看出罐壓在0.1Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸可以達(dá)到0.25%，隨著罐壓的降低，產(chǎn)酸速率也在降低，當(dāng)罐壓降至0.02Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸僅為0.08%。在檸檬酸發(fā)酵中，較高的罐壓不僅增加菌體產(chǎn)酸所需的溶解氧，還可以增加二氧化碳的溶解度，促進(jìn)二氧化碳的固定。

表4 不同罐壓對產(chǎn)酸速率的影響

2.5 尿素的添加量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量過于豐富，菌生長代謝加快，雖對縮短發(fā)酵周期有利，但不利于檸檬酸積累，產(chǎn)酸率不高；但是氮源含量過少又不利于菌體生長發(fā)育[5]。本實(shí)驗(yàn)控制發(fā)酵起始pH5.0～5.5，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，接種量10%，以木薯清液為基料，加入不同量的尿素以調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源含量，確定尿素的最適添加量。其產(chǎn)酸結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，尿素添加量在0.6%時產(chǎn)酸最高。尿素添加量低于此值，則氮源偏低而影響產(chǎn)酸，尿素添加量超過此值可能會對菌體產(chǎn)生一定的毒性從而影響菌體生長代謝。

表5 尿素添加量對產(chǎn)酸的影響

3 結(jié)束語

以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%（w/v），殘總糖≤1.0%（w/v），糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

參考文獻(xiàn)

[1]金其榮.有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京： 中國輕工業(yè)出版社，1992.

[2]朱儉.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].上海： 上海科學(xué)技術(shù)出版社， 1981.

[3]陳堅，堵國成，李寅，等.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].化學(xué)工業(yè)出版社， 2003： 70-71.

[4]陳燕飛.pH對微生物的影響[J].太原師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.檸檬酸發(fā)酵[M].食品與發(fā)酵工業(yè)， 1994（06）： 69-74.endprint

摘 要：以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%，殘總糖≤1.0%，糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

關(guān)鍵詞：木薯清液；檸檬酸；黑曲霉

玉米清液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸已經(jīng)被全國不少廠家所使用，該工藝克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，為農(nóng)副產(chǎn)品深加工找到了一條出路，但是對玉米需求量的增大會使全球糧食危機(jī)加重。木薯產(chǎn)量高，不與主要糧食爭地，價格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生產(chǎn)檸檬酸的理想替代物，采用清液發(fā)酵具有發(fā)酵液固形物少，濾液清，油脂少，利于檸檬酸后提取，提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量等特點(diǎn)。且液化后得到的濾渣可用于制備高品質(zhì)的蛋白飼料。目前全國已有不少工廠以木薯粉為原料生產(chǎn)檸檬酸，文章進(jìn)行了以木薯清液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵的工藝研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中糧安徽生物化學(xué)有限公司菌種室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：采用土豆瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充2%的玉米漿作為氮源。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充適量尿素作為氮源。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面33℃，培養(yǎng)5～7d。種子罐采用5L單層平葉全自動發(fā)酵罐36℃培養(yǎng)20～24h，風(fēng)量1：0.4vvm，轉(zhuǎn)速300rpm，接入106個/ml的孢子。發(fā)酵罐采用50L三層平葉全自動發(fā)酵罐，裝液量30L，風(fēng)量1：0.2vvm，轉(zhuǎn)速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制備

按25%（m/v）的粉漿比對木薯粉進(jìn)行調(diào)漿，按50U/g絕干淀粉的量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃液化至碘試合格，離心取清液。

1.5 分析方法

pH測定：采用pH計測定。

產(chǎn)酸測定：發(fā)酵液經(jīng)普通濾紙過濾后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH為1%酸度。

總糖測定：經(jīng)6mol/L硫酸水解后，用費(fèi)林法測定[1]。

還原糖測定：直接用費(fèi)林法測定[1]。

蛋白質(zhì)測定：用凱氏定氮法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

檸檬酸發(fā)酵接種量的多少，直接決定于進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量[3]。菌絲球接種數(shù)一般與孢子數(shù)成正比。從表1中可以看出，菌絲球接種量大小對產(chǎn)酸率有一定的影響，在一定的范圍內(nèi)，接種量越大，產(chǎn)酸越高。但接種量過大會影響發(fā)酵的有效體積，本實(shí)驗(yàn)條件下，接種量在10～12%較為合適。

表1 接種量對產(chǎn)酸的影響

2.2 起始pH對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

接種量10%，考察不同起始pH對玉米清液發(fā)酵的影響。從表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0較為合適。起始pH較低（4.5以下），可能會影響糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值為大于5.5時，可能由于接近中性的條件下，細(xì)胞表面電荷減少，菌體間的斥力減弱而使菌球聚集，致使發(fā)酵產(chǎn)酸很慢[4]。

表2 起始pH對產(chǎn)酸的影響

2.3 發(fā)酵溫度控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

從表3可以看出，溫度低于35℃高于39℃時，菌體產(chǎn)酸水平較低。菌體最佳發(fā)酵溫度為37～39℃。溫度低于35℃時可能影響菌體生長從而導(dǎo)致產(chǎn)酸緩慢，發(fā)酵周期較長。溫度高于39℃時，發(fā)酵周期雖然縮短，但轉(zhuǎn)化率偏低，可能由于溫度過高導(dǎo)致菌體及雜酸產(chǎn)生過量，菌體易早衰，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。

表3 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸的影響

2.4 罐壓控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

發(fā)酵罐通風(fēng)時還要維持一定的罐壓，在一定范圍內(nèi)，氣體的溶解度與罐壓成正比。從表4可以看出罐壓在0.1Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸可以達(dá)到0.25%，隨著罐壓的降低，產(chǎn)酸速率也在降低，當(dāng)罐壓降至0.02Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸僅為0.08%。在檸檬酸發(fā)酵中，較高的罐壓不僅增加菌體產(chǎn)酸所需的溶解氧，還可以增加二氧化碳的溶解度，促進(jìn)二氧化碳的固定。

表4 不同罐壓對產(chǎn)酸速率的影響

2.5 尿素的添加量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量過于豐富，菌生長代謝加快，雖對縮短發(fā)酵周期有利，但不利于檸檬酸積累，產(chǎn)酸率不高；但是氮源含量過少又不利于菌體生長發(fā)育[5]。本實(shí)驗(yàn)控制發(fā)酵起始pH5.0～5.5，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，接種量10%，以木薯清液為基料，加入不同量的尿素以調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源含量，確定尿素的最適添加量。其產(chǎn)酸結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，尿素添加量在0.6%時產(chǎn)酸最高。尿素添加量低于此值，則氮源偏低而影響產(chǎn)酸，尿素添加量超過此值可能會對菌體產(chǎn)生一定的毒性從而影響菌體生長代謝。

表5 尿素添加量對產(chǎn)酸的影響

3 結(jié)束語

以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%（w/v），殘總糖≤1.0%（w/v），糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

參考文獻(xiàn)

[1]金其榮.有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京： 中國輕工業(yè)出版社，1992.

[2]朱儉.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].上海： 上海科學(xué)技術(shù)出版社， 1981.

[3]陳堅，堵國成，李寅，等.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].化學(xué)工業(yè)出版社， 2003： 70-71.

[4]陳燕飛.pH對微生物的影響[J].太原師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.檸檬酸發(fā)酵[M].食品與發(fā)酵工業(yè)， 1994（06）： 69-74.endprint

摘 要：以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%，殘總糖≤1.0%，糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

關(guān)鍵詞：木薯清液；檸檬酸；黑曲霉

玉米清液發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸已經(jīng)被全國不少廠家所使用，該工藝克服了薯干、糖蜜等原料的一些弊端，為農(nóng)副產(chǎn)品深加工找到了一條出路，但是對玉米需求量的增大會使全球糧食危機(jī)加重。木薯產(chǎn)量高，不與主要糧食爭地，價格低廉，淀粉含量高，是取代玉米等原料生產(chǎn)檸檬酸的理想替代物，采用清液發(fā)酵具有發(fā)酵液固形物少，濾液清，油脂少，利于檸檬酸后提取，提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量等特點(diǎn)。且液化后得到的濾渣可用于制備高品質(zhì)的蛋白飼料。目前全國已有不少工廠以木薯粉為原料生產(chǎn)檸檬酸，文章進(jìn)行了以木薯清液進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵的工藝研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger） 由中糧安徽生物化學(xué)有限公司菌種室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：采用土豆瓊脂培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充2%的玉米漿作為氮源。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯液化清液，補(bǔ)充適量尿素作為氮源。

1.3 培養(yǎng)條件

斜面33℃，培養(yǎng)5～7d。種子罐采用5L單層平葉全自動發(fā)酵罐36℃培養(yǎng)20～24h，風(fēng)量1：0.4vvm，轉(zhuǎn)速300rpm，接入106個/ml的孢子。發(fā)酵罐采用50L三層平葉全自動發(fā)酵罐，裝液量30L，風(fēng)量1：0.2vvm，轉(zhuǎn)速350rpm。

1.4 木薯液化清液的制備

按25%（m/v）的粉漿比對木薯粉進(jìn)行調(diào)漿，按50U/g絕干淀粉的量加入耐高溫α-淀粉酶，90℃液化至碘試合格，離心取清液。

1.5 分析方法

pH測定：采用pH計測定。

產(chǎn)酸測定：發(fā)酵液經(jīng)普通濾紙過濾后，用0.1429mol/LNaOH滴定，每消耗1ml NaOH為1%酸度。

總糖測定：經(jīng)6mol/L硫酸水解后，用費(fèi)林法測定[1]。

還原糖測定：直接用費(fèi)林法測定[1]。

蛋白質(zhì)測定：用凱氏定氮法[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

檸檬酸發(fā)酵接種量的多少，直接決定于進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)的孢子數(shù)量[3]。菌絲球接種數(shù)一般與孢子數(shù)成正比。從表1中可以看出，菌絲球接種量大小對產(chǎn)酸率有一定的影響，在一定的范圍內(nèi)，接種量越大，產(chǎn)酸越高。但接種量過大會影響發(fā)酵的有效體積，本實(shí)驗(yàn)條件下，接種量在10～12%較為合適。

表1 接種量對產(chǎn)酸的影響

2.2 起始pH對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

接種量10%，考察不同起始pH對玉米清液發(fā)酵的影響。從表2可以看出，pH值控制在4.5～5.0較為合適。起始pH較低（4.5以下），可能會影響糖化酶活力而使原料不能充分糖化。而pH值為大于5.5時，可能由于接近中性的條件下，細(xì)胞表面電荷減少，菌體間的斥力減弱而使菌球聚集，致使發(fā)酵產(chǎn)酸很慢[4]。

表2 起始pH對產(chǎn)酸的影響

2.3 發(fā)酵溫度控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

從表3可以看出，溫度低于35℃高于39℃時，菌體產(chǎn)酸水平較低。菌體最佳發(fā)酵溫度為37～39℃。溫度低于35℃時可能影響菌體生長從而導(dǎo)致產(chǎn)酸緩慢，發(fā)酵周期較長。溫度高于39℃時，發(fā)酵周期雖然縮短，但轉(zhuǎn)化率偏低，可能由于溫度過高導(dǎo)致菌體及雜酸產(chǎn)生過量，菌體易早衰，影響糖酸轉(zhuǎn)化率。

表3 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸的影響

2.4 罐壓控制對木薯清液發(fā)酵檸檬酸的影響

發(fā)酵罐通風(fēng)時還要維持一定的罐壓，在一定范圍內(nèi)，氣體的溶解度與罐壓成正比。從表4可以看出罐壓在0.1Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸可以達(dá)到0.25%，隨著罐壓的降低，產(chǎn)酸速率也在降低，當(dāng)罐壓降至0.02Mpa時，平均每小時產(chǎn)酸僅為0.08%。在檸檬酸發(fā)酵中，較高的罐壓不僅增加菌體產(chǎn)酸所需的溶解氧，還可以增加二氧化碳的溶解度，促進(jìn)二氧化碳的固定。

表4 不同罐壓對產(chǎn)酸速率的影響

2.5 尿素的添加量對木薯清液發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量過于豐富，菌生長代謝加快，雖對縮短發(fā)酵周期有利，但不利于檸檬酸積累，產(chǎn)酸率不高；但是氮源含量過少又不利于菌體生長發(fā)育[5]。本實(shí)驗(yàn)控制發(fā)酵起始pH5.0～5.5，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，接種量10%，以木薯清液為基料，加入不同量的尿素以調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源含量，確定尿素的最適添加量。其產(chǎn)酸結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，尿素添加量在0.6%時產(chǎn)酸最高。尿素添加量低于此值，則氮源偏低而影響產(chǎn)酸，尿素添加量超過此值可能會對菌體產(chǎn)生一定的毒性從而影響菌體生長代謝。

表5 尿素添加量對產(chǎn)酸的影響

3 結(jié)束語

以木薯清液為原料，用50L發(fā)酵罐進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10～12%，發(fā)酵起始pH值控制為4.5～5.0，發(fā)酵溫度37～39℃，罐壓0.1Mpa，尿素添加量為0.6%，發(fā)酵68h產(chǎn)酸可達(dá)16.5%（w/v），殘總糖≤1.0%（w/v），糖酸轉(zhuǎn)化率≥98.1%。

參考文獻(xiàn)

[1]金其榮.有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)[M].北京： 中國輕工業(yè)出版社，1992.

[2]朱儉.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1981.

[3]陳堅，堵國成，李寅，等.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].化學(xué)工業(yè)出版社， 2003： 70-71.

[4]陳燕飛.pH對微生物的影響[J].太原師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2009（3）： 121-124.

[5]朱亨政.檸檬酸發(fā)酵[M].食品與發(fā)酵工業(yè)， 1994（06）： 69-74.endprint