王巧玲，鄒金華，劉東華，岳潔瑜

(天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學，天津 300387)

外源鈣(Ca)對毛蔥耐鎘(Cd)脅迫能力的影響

王巧玲，鄒金華，劉東華，岳潔瑜*

(天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學，天津 300387)

以對環(huán)境敏感的毛蔥(Alliumcepavar.agrogarumL.)為材料，通過水培試驗分別研究不同濃度Ca(0、0.1、1、10 mmol/L)對 Cd(10 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L)脅迫下毛蔥幼苗生長、葉片光合特性、體內(nèi) Cd 積累和礦質(zhì)營養(yǎng)的變化，探討Ca 緩解敏感植物Cd 毒害的生理生化機制。結(jié)果表明：(1) Cd顯著抑制了毛蔥的生長并導致其根端彎曲、發(fā)黃，葉片綠色加深；外源Ca顯著削弱了Cd的毒害，緩解了其對毛蔥生長的抑制；(2)Cd導致毛蔥葉片光合色素含量大幅度上升卻顯著降低了毛蔥的光合作用；外源Ca延緩了光合色素上升的速度，提高了毛蔥的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率；(3)Cd脅迫導致毛蔥體內(nèi)Cd 含量顯著增加，并造成明顯的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，主要表現(xiàn)為顯著降低了毛蔥根中Mg、Mn，葉中Ca、Mg、Mn、Zn等元素的含量，毛蔥根中Ca、Fe、Zn，葉中Fe元素含量的顯著增加，擾亂了毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)；外源Ca削弱了毛蔥對 Cd 的積累，減輕了Cd 脅迫所造成的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡。因此，外源Ca能通過抑制 Cd的吸收，促進葉片光合作用及氣體交換速率，維持植物體的含水量、植物葉片光合色素含量及礦質(zhì)營養(yǎng)的平衡等途徑來增強毛蔥對Cd 脅迫的耐性。

毛蔥；Cd；Ca；脅迫；耐性

鎘(Cd)是一種毒性很大的重金屬元素，對植物的生長發(fā)育造成傷害，如抑制植物對水分的吸收和運輸，抑制光合作用和呼吸作用；對能量轉(zhuǎn)化和蛋白合成造成紊亂；導致營養(yǎng)失衡和超微結(jié)構(gòu)損傷等[1- 5]。植物亦通過不同的生理、生化機制對Cd脅迫作出反應(yīng)。鑒于此，國內(nèi)外對如何解除或緩解Cd脅迫的重視程度日益加深。鈣(Ca)是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素, 而且能夠作為第二信使與 CaM(Calmodulin)結(jié)合偶聯(lián)胞外信號與胞內(nèi)生理生化反應(yīng)，通過穩(wěn)定細胞壁、細胞膜結(jié)構(gòu)[6]及誘導特異基因的表達來提高植物對逆境的抗性[7]。已有研究表明，外源鈣可增強植物對許多非生物逆境的適應(yīng)性，提高植物對重金屬毒害的耐性，減輕重金屬對植物所造成的傷害[8- 9]。

洋蔥(Alliumcepa)不僅是非常重要的蔬菜作物，而且對環(huán)境變化敏感，是環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)選植物[10]。毛蔥(Alliumcepavar.agrogarumL.)作為洋蔥的一個變種(百合科蔥屬)，除了具有洋蔥易培養(yǎng)，根系粗壯發(fā)達，對環(huán)境因子敏感，染色體數(shù)目較少(2n=16)，形態(tài)特征明顯等優(yōu)點外，毛蔥還具有體積小，休眠期短的獨特優(yōu)點[11]。目前，有關(guān)鈣調(diào)節(jié)Cd對毛蔥脅迫方面的研究鮮有報道。本研究以毛蔥為試驗材料，探討外源Ca 對Cd脅迫下毛蔥幼苗生理生化特性的影響，為緩解重金屬Cd對生物的毒害找到經(jīng)濟、有效的方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)與處理

試驗材料為毛蔥(Alliumcepavar.agrogarumL.)。選取100頭大小均勻一致、飽滿、色澤勻稱、表皮光滑、健康無損傷、未萌發(fā)根也未長綠葉的毛蔥鱗莖為實驗材料。剝?nèi)ネ獠康母稍锬べ|(zhì)鱗葉，洗凈，在室溫下(25 ℃)用自來水培養(yǎng)，每隔12 h換1次水。經(jīng)自來水培養(yǎng)至剛長出葉片后，從中選取80頭生長一致的毛蔥，平均分成16組進行處理。在預(yù)試驗中，篩選出10、100 μmol/L和300 μmol/L CdCl2為適合的Cd脅迫濃度，其中10 μmol/L CdCl2對毛蔥幼苗的生長無明顯的脅迫作用，100 μmol/L CdCl2既對毛蔥幼苗產(chǎn)生脅迫作用，又不會造成嚴重的Cd毒害，300 μmol/L CdCl2可對毛蔥幼苗產(chǎn)生嚴重的毒害。在3個Cd處理組中，分別加入0、0.1(低鈣)、1(中鈣)、10 mmol/L(高鈣)的Ca，以不施Cd和Ca為對照，具體處理分組見表1。對照及實驗組材料均在50% Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，實驗組中Cd和Ca是直接溶解于50% Hoagland營養(yǎng)液中，實驗周期為12 d，整個實驗過程中對培養(yǎng)液通氣，每4 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態(tài)觀察及株高、根長測定

實驗期內(nèi)每天記錄毛蔥幼苗生長狀況，第12天時測定毛蔥幼苗的株高、根長，每處理組測量5個植株，每個植株測量5組數(shù)據(jù)。數(shù)碼相機拍照。

表1 實驗組編號

1.2.2 光合色素含量測定

樣品稱重后，于研缽中加入80%丙酮10 mL，將其充分研磨，移入錐形瓶后用封口膜封口，4℃過夜萃取至材料殘渣變白，4000×g離心20 min，取上清液，即為色素提取液[12]。測定提取液在波長663，646，470 nm處的光吸收值，按 Lichtenthaler[13]公式計算。

1.2.3 光合速率及氣體交換數(shù)據(jù)的測定

處理12 d時，對16組毛蔥進行光合作用及氣體交換指數(shù)的測定，凈光合速率(Pn, μmol CO2·m-2·s-1)、氣孔導度(Gs, mmol H2O ·m-2·s-1)及蒸騰速率(Tr, mmol H2O·m-2·s-1)等用LI- 340(CID Co.，USA)手持式光合儀進行測定。測定每株毛蔥長勢最好的功能葉，每組測定5株，每株測量5個葉片。測量要迅速，測定時間控制在10:00—12:00。

1.2.4 電感耦合等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)制樣及分析

材料處理12 d后收獲。分別收集每個實驗組毛蔥的根系和葉片，共32個樣品。每個樣品分成相同質(zhì)量的5組，稱重后，將樣品分別置于烘箱中烘干：45 ℃，4 d；80 ℃，2 d；105 ℃，過夜。烘干后的樣品稱重后研磨至粉末，移入干燥瓶中保存，用于消化分析。稱0.2 g粉末于小燒杯中，加入5 mL濃硝酸(Analytical Reagent, AR)浸泡過夜；加入2 mL高氯酸(AR)后80 ℃加熱3 h，溫度升至120 ℃，將剩余硝酸揮發(fā)殆盡。冷卻后再加入3 mL濃硝酸、2mL高氯酸(AR)，緩慢加熱，待燒杯中溶液呈橙黃色時，再加入2 mL高氯酸(AR)，溫度升至200 ℃，至燒杯中有白色晶體析出。樣品冷卻后，用10%的硝酸溶液溶解并準確定容至25 mL，用ICP-AES(LEEMAN LABS INC., New Hampshire, USA)測定Cd在毛蔥各器官中的積累量，并測定根系、葉片中Ca、Mg、Mn、Fe、Zn的含量。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Sigmaplot 8.0軟件處理除光合特性以外所有數(shù)據(jù)并作圖，用excel 2003軟件處理光合特性數(shù)據(jù)，并用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥生長的影響

2.1.1 對毛蔥形態(tài)特征的影響

不同濃度外源Ca對Cd脅迫下的毛蔥處理12 d后，可明顯緩解Cd脅迫造成的毒害(圖1)。Cd對毛蔥造成毒害，使其形態(tài)發(fā)生明顯的變化，濃度越高其毒害作用越明顯。與對照相比，Cd處理組的毛蔥生長緩慢，植株矮小，葉片綠色加深，根長受到顯著抑制，顏色暗黃，變粗變脆(圖1 b, c, d)。在高濃度Cd(100 μmol/L和300 μmol/L)處理組中，與對照組葉片的黃綠色不同，其葉片呈暗綠色夾雜白色小枯斑，根端極度彎曲，發(fā)黃呈腐爛狀(圖1 c, d)。

外源Ca對Cd脅迫下毛蔥形態(tài)的影響不同(圖1)：A組和B組毛蔥并未因Ca的加入表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異(圖1 a, b)；但在C組和D組中，外源Ca對毛蔥的毒害有顯著的緩解作用，且隨外源Ca濃度的增加，其緩解效果也越明顯(圖1 c, d)。

2.1.2 對毛蔥株高、根長的影響

Cd顯著抑制毛蔥的株高和根長(圖2)。外源Ca對A、B組毛蔥的株高和根長無明顯的影響，但對C、D組毛蔥表現(xiàn)出明顯的緩解作用(圖2)。A、B組中，施加外源Ca后毛蔥的株高和根長均無顯著性差異(P> 0.05)(圖2)。C、D組中，對毛蔥株高產(chǎn)生明顯影響的外源Ca濃度與對根長產(chǎn)生明顯影響的外源Ca濃度不同：10 mmol/L的外源Ca緩解Cd對毛蔥株高的毒害作用，C4、D4組毛蔥的株高分別比C1、D1組毛蔥增高了26.5%和61.5%(圖2)；C組中，1 mmol/L的外源Ca顯著緩解了Cd對毛蔥根長的抑制作用，C3組毛蔥的根長比C1組增加12.1%(圖2)。

圖1 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥生長及形態(tài)特征的影響(12 d)Fig.1 Effects of exogenous Ca on morphological characteristics of Allium cepa var. agrogarum L. under Cd stress over 12 days

圖2 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥株高和根長的影響Fig.2 Effects of exogenous Ca on plant height and root length of Allium cepa var. agrogarum L. under Cd stressA：A實驗組(1，2，3，4：A1，A2，A3，A4); B：B實驗組(1，2，3，4；B1，B2，B3，B4); C：C實驗組(1，2，3，4：C1，C2，C3，C4); D：D實驗組(1，2，3，4：D1，D2，D3，D4); 同一實驗組中字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

2.2 外源Ca對 Cd 脅迫下毛蔥葉片光合色素含量的影響

圖3表明，Cd脅迫毛蔥12 d后導致其葉綠素a含量的顯著增加，處理組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。不同濃度外源Ca對葉綠素a的增加幅度有明顯的影響。外源Ca濃度為0.1 mmol/L時，對葉綠素a含量的增加沒有明顯影響；Ca濃度至1 mmol/L時，能有效緩解除10、100μmol/L處理組毛蔥葉片葉綠素a含量的驟升；外施Ca濃度升至10 mmol/L時，對100、300 μmol/L Cd處理組毛蔥的緩解作用反而減弱，只對10 μmol/L Cd處理毛蔥葉片葉綠素a含量的驟升有明顯的抑制作用，使其恢復(fù)到正常水平。

Cd對毛蔥葉片葉綠素b含量的影響與對葉綠素a含量的影響明顯不同(圖3)。300 μmol/L Cd處理導致毛蔥葉片的葉綠素b含量顯著上升(P<0.05)，其它濃度的Cd處理組與對照組之間無顯著性差異(P> 0.05)。10 mmol/L外源Ca顯著抑制Cd脅迫毛蔥葉片葉綠素b含量的上升，使其含量與對照組無顯著性差異(P> 0.05)(圖3)。

類胡蘿卜素存在于所有光合生物中，是光合作用的輔助色素，能將吸收的光能傳遞給葉綠素分子，在捕光色素復(fù)合體的組裝中承擔重要的結(jié)構(gòu)性作用。高濃度的Cd(100 μmol/L和300 μmol/L)能顯著增加類胡蘿卜素的含量(P<0.05)(圖3)。10 mmol/L外源Ca可緩解100 μmol/L Cd毒害，低于此濃度的Ca均未對類胡蘿卜素的含量產(chǎn)生影響(圖3)。

圖3 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥光合色素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous Ca on leaf pigment content of Allium cepa var. agrogarum L. under Cd stress同列字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

2.3 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥葉片光合特性的影響

2.3.1 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥葉片凈光合速率的影響

凈光合速率(Pn)是反映光合作用強弱的最重要指標，凈光合速率越大，植物光合作用的水平越高，反之亦然。Cd脅迫下毛蔥葉片凈光合速率受到明顯的影響，隨Cd處理濃度的增加而明顯降低(圖4)。Cd脅迫毛蔥12 d后，10、100 μmol/L和300 μmol/L Cd處理組毛蔥其葉片凈光合速率比對照組分別下降了24.2%、75.8% 和85.4%。外源Ca對其下降幅度有明顯的影響。具體表現(xiàn)為，0.1 mmol/L Ca對Cd的毒害無明顯緩解作用；1 mmol/L Ca顯著緩解300 μmol/L Cd的毒害(P<0.05)；10 mmol/L外源Ca比1 mmol/L Ca緩解效果更明顯，對100 μmol/L和300 μmol/L Cd毒害均有明顯緩解作用(圖4)。

圖4 不同濃度Ca對Cd脅迫下毛蔥處理12 d后凈光合速率(Pn)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Ca on the net photosynthetic rate (Pn) in Allium cepa var. agrogarum L. exposed to Cd stress over 12 d同一實驗組中字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

2.3.2 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥葉片氣孔導度的影響

氣孔導度(Gs，單位為mmol H2O·m-2·s-1)，影響植物的光合作用和蒸騰作用。不同濃度的Cd對毛蔥葉片的氣孔導度有不同程度的抑制作用(圖5)。10、100 μmol/L和300 μmol/L Cd處理毛蔥12 d后，其葉片的氣孔導度比對照組分別下降了19.8%、42.7% 和81.3%。施加外源Ca顯著降低了A組葉片的氣孔導度(P<0.05)，但對B、C、D組葉片的氣孔導度沒有明顯的影響(圖5)。

圖5 不同濃度Ca對Cd脅迫下毛蔥處理12 d后氣孔導度(Gs)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of Ca on the stomatal conductance (Gs) in Allium cepa var. agrogarum L. exposed to Cd stress over 12 days同一實驗組中字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

2.3.3 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥葉片蒸騰速率的影響

蒸騰作用是植物吸收水分和轉(zhuǎn)運水分的主要動力，對維持植物各部分的水分飽和，保持細胞組織的形態(tài)，促進無機鹽類在植物體內(nèi)的分布具有重要的作用。對比圖6和圖5可以看出，蒸騰速率(Tr)和氣孔導度的變化趨勢一致。不同濃度Cd脅迫毛蔥12 d后，10、100 μmol/L和300 μmol/L Cd處理后毛蔥葉片的蒸騰速率分別比對照下降了14.2%、43.1%和78.0%。施加外源Ca顯著降低了A組葉片的蒸騰速率(P<0.05)；外源Ca顯著緩解了100 μmol/L Cd對毛蔥的毒害(P<0.05)，提高了毛蔥葉片的蒸騰速率，尤其當Ca濃度大于1 mmol/L時，緩解效果尤為明顯；外源Ca對B、C、D組葉片的蒸騰速率沒有明顯的影響(圖6)。

圖6 不同濃度Ca對Cd脅迫下毛蔥處理12 d后蒸騰速率(Tr)的影響Fig.6 Effects of different concentrations of Ca on the transpiration rate (Tr) in Allium cepa var. agrogarum L. exposed to Cd stress over 12 days同一實驗組中字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

2.4 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥Cd含量及營養(yǎng)元素吸收的影響

2.4.1 外源Ca對Cd脅迫下毛蔥含水量的影響

Cd顯著降低毛蔥體內(nèi)的含水量，施加外源Ca能明顯的減緩其降低幅度(圖7)。本研究中毛蔥幼苗根系的鮮干重比與Cd 濃度呈負相關(guān)，B1、C1、D1組幼苗(10—300 μmol/L)根系的鮮干重比始終顯著低于A1組(對照組)(P<0.05)且各處理組間差異顯著(P<0.05)。施加外源Ca后各實驗組毛蔥根系的鮮干重比均先升高后隨著Ca濃度的提高(>0.1 mmol/L)而逐漸降低，在Ca濃度為10 mmol/L 時最低(圖7)。

圖7 不同濃度Ca對Cd脅迫毛蔥12 d后各器官鮮干重比值的影響Fig.7 Effects of different concentrations of Ca on the fresh and dry weights ratio in Allium cepa var. agrogarum L. exposed to Cd stress over 12 days 同列字母完全不同表示差異顯著(n=15，P<0.05)

毛蔥葉片鮮干重比的變化趨勢與根系不完全一致(圖7)。毛蔥葉片的的鮮干重比與Cd濃度呈現(xiàn)負相關(guān)，除C1和D1組外其它各實驗組間差異顯著(P<0.05)。施加外源Ca后，A組中毛蔥葉片鮮干重比的變化趨勢與根系保持一致。B、C、D組在Ca濃度為0.1 mmol/L 時比值均下降，與根系的變化趨勢相反；當Ca濃度為1 mmol/L 時，B組比值上升，C、D組均下降；當Ca濃度至10 mmol/L時，B、C、D各組葉片的變化趨勢正好與1 mmol/L Ca處理組相反(圖7)。

2.4.2 外源Ca對Cd 脅迫下毛蔥體內(nèi) Cd 含量的影響

Cd處理后毛蔥體內(nèi)Cd含量隨Cd濃度上升而增加，但Cd在毛蔥根系中的積累量遠遠高于葉片中的含量(圖8)。施加外源Ca顯著降低了B、C、D組毛蔥根系和葉片中Cd的積累量(P<0.05)。

圖8 不同濃度Ca對Cd脅迫下毛蔥12 d后，Cd在毛蔥體內(nèi)不同器官中的積累和分布Fig.8 Cadmium uptake and accumulation by Allium cepa var. agrogarum L. under cadmium stress, after 12 days cultivation with different concentration of Ca 同一實驗組中字母完全不同表示差異顯著(n=5，P<0.05)

外源Ca對毛蔥根系中Cd的積累量有明顯的影響(圖8)。B組中，1 mmol/L外源Ca顯著促進Cd在毛蔥根系中的積累(P<0.05)，10 mmol/L Ca對其積累量無明顯影響。在C、D組中，10 mmol/L外源Ca能顯著降低Cd在根系的積累(P<0.05)；D組中，0.1 mmol/L外源Ca能顯著降低Cd在毛蔥根系中的積累(P<0.05)，隨著Ca濃度的升高，降低效果更為顯著(圖8)。

與外源Ca對毛蔥根系中Cd的積累的影響一致，毛蔥葉片中Cd的積累量隨著施加外源Ca而明顯降低(圖8)。與根不同的是，0.1 mmol/L的Ca就能顯著降低C組葉片中Cd的積累量；而在D組中，0.1 mmol/L和1 mmol/L 外源Ca對毛蔥葉片中Cd的積累量沒有產(chǎn)生明顯的影響(P> 0.05)(圖8)。

2.4.3 外源Ca對Cd 脅迫下毛蔥營養(yǎng)元素吸收的影響

Cd脅迫造成毛蔥體內(nèi)明顯的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，主要表現(xiàn)為顯著降低毛蔥根中Mg、Mn，葉中Ca、Mg、Mn、Zn等元素的含量；顯著增加毛蔥根中Ca、Fe、Zn，葉中Fe元素的含量，擾亂毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)；外源Ca削弱了Cd 脅迫造成的礦質(zhì)元素失衡，穩(wěn)定了毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)(表2)。

Cd造成毛蔥根系中鈣(Ca)含量顯著高于對照組(A1)(P<0.05)并隨Cd濃度的升高而增加；不同濃度的外源Ca對Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)鈣(Ca)的代謝與利用有不同的影響(表2)。A組中，外源Ca濃度低于10 mmol/L時顯著降低毛蔥根系中Ca的含量(P<0.05)；當Ca濃度升至10 mmol/L時，根系中Ca的積累量顯著高于對照組(P<0.05)。B、C、D組中，外源Ca顯著降低毛蔥根系Ca含量。Ca在毛蔥葉片中的吸收和積累情況與根系中明顯不同(表2)。Cd顯著降低毛蔥葉片中的Ca含量。A組中，外源Ca濃度為0.1、1和10 mmol/L時，葉片中Ca的含量比對照組分別增加了17.3%、37.8% 和44.7%；B、C、D組中，Ca在毛蔥葉片的積累隨外源Ca濃度的變化趨勢與根系保持一致。A組施加外源Ca后，毛蔥體內(nèi)Ca含量較對照組顯著增加(P<0.05)；而B、C、D組中毛蔥體內(nèi)Ca含量卻隨著外源Ca的施加而減少。

Cd顯著地抑制了毛蔥對鎂(Mg)的吸收和積累；不同濃度外源Ca對Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Mg的代謝與利用有不同的影響(表2)。毛蔥根系Mg含量顯著受到外源Ca的影響。A組中，施加外源Ca后，毛蔥根系中Mg含量較對照組顯著降低(P<0.05)，0.1 mmol/L Ca對其降低效果最明顯僅為對照組(A1)的83.3%；B、C、D組中0.1 mmol/L 外源Ca施加組(B2、C2、D2)，毛蔥根系中Mg含量僅為其無Ca組(B1、C1、D1)含量的71.0%、96.0%和63.9%(表2)。毛蔥葉片中Mg含量也明顯受到外源Ca的影響(表2)。與根系中Mg含量不同的是，A組中，0.1 mmol/L 外源Ca處理下毛蔥葉片中Mg含量高于對照組及其它Ca處理組(P<0.05)。隨著Ca濃度的升高，葉片中Mg的積累量逐漸下降，10 mmol/L時達最低且顯著低于對照組(P<0.05)；B、C、D組與A組變化趨勢一致。0.1 mmol/L外源Ca能顯著降低毛蔥根系中Mg含量并隨外源Ca濃度的增加降低幅度減小；葉片中Mg含量在0.1 mmol/L外源Ca組中顯著增加，但其增加幅度隨外源Ca濃度的升高而減小(表2)。

Cd顯著促進了毛蔥對鐵(Fe)的吸收(P<0.05)；不同濃度外源Ca對Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Fe的代謝與利用有不同的影響(表2)。根系中：A、B組Fe含量隨外源Ca濃度的升高而增加，其中A4、B4組Fe含量分別為A1、B1組的143.7% 和130.6%；C、D組Fe含量在外源Ca濃度為0.1 mmol/L(C2、D2組)時最大，其值分別為C1組、D1組的107.2% 和119.1%，當外源Ca濃度大于0.1 mmol/L時，毛蔥根系中Fe含量逐漸減少(表2)。葉片中：A、C和D實驗組均在外源Ca濃度為0.1 mmol/L(A2、C2、D2組)時葉片中Fe含量最大，其值分別比A1、C1和D1組增加了111.3%、61.5%和44.0%，外源Ca濃度大于0.1 mmol/L時，毛蔥葉片中Fe含量逐漸減少；B組中，毛蔥葉片中Fe含量在Ca濃度為1 mmol/L最大，為B1組的124.7%。因此，施加外源Ca能顯著增加毛蔥體內(nèi)Fe的積累量，0.1 mmol/L Ca效果最明顯。

Cd顯著抑制了毛蔥對錳(Mn)的積累(P<0.05)；不同濃度外源Ca對Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Mn的代謝與利用有不同的影響(表2)。A實驗組中，外源Ca會顯著降低毛蔥根系中Mn的積累量(P<0.05)，Ca濃度為0.1 mmol/L時含量達最低，為對照組的68.7%；B、C、D實驗組中，外源Ca也會顯著降低毛蔥根系中Mn的積累量(P<0.05)，但只有當Ca濃度升至10 mmol/L時才會使毛蔥根中Mn的積累量達到各組的最低含量(表2)。與根系不同的是，外源Ca會顯著增加A組中毛蔥葉片中Mn的含量(P<0.05)，在Ca濃度為0.1 mmol/L時葉片中Mn含量達最高為A1組的157.5%；B、C、D實驗組中，毛蔥葉片中Mn含量隨外源Ca濃度的施加而降低(表2)。因此，外源Ca能顯著降低Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Mn的積累量。

Cd顯著促進了毛蔥根系對鋅(Zn)的積累卻顯著抑制了葉片對Zn的積累(P<0.05)；不同濃度外源Ca對Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Zn的代謝與利用的影響不同(表2)。A組中，外源Ca能顯著促進毛蔥根系對Zn的吸收(P<0.05)，0.1 mmol/L Ca處理組比對照組增加了29.8%；B組中，外源Ca顯著增加毛蔥根系中Zn的含量(P<0.05)，當Ca濃度為1 mmol/L時達到Zn積累量的最大值，為B1組的122.1%；C組中10 mmol/L Ca對根中Zn的含量產(chǎn)生顯著抑制作用(P<0.05)，低于此濃度的Ca對其均無明顯影響；D組中，外源Ca能顯著抑制毛蔥根中Mn含量(P<0.05)，Ca濃度為1 mmol/L時含量最低，比D1組下降36.8%(表2)。毛蔥葉片中Zn的積累與根系的變化趨勢不同(表2)。A組中，當外源Ca濃度為0.1 mmol/L時可顯著促進Zn在毛蔥葉片的積累(P<0.05)，而10 mmol/L的Ca顯著抑制Zn在毛蔥葉片的含量(P<0.05)，1 mmol/L Ca對其無明顯影響(P>0.05)；B實驗組，0.1mmol/L Ca顯著地促進Zn在毛蔥葉片中的積累(P<0.05)，但當Ca濃度上升時，其對Zn在毛蔥葉片的積累量與B1組無顯著差異(P> 0.05)；C實驗組中外源Ca未對Zn在毛蔥葉片的積累產(chǎn)生明顯影響；D實驗組中，外源Ca能顯著增加毛蔥根中Mn的含量(P<0.05)。

3 討論

3.1 外源Ca對 Cd 脅迫下毛蔥生長的影響

株高根長是水培模擬試驗中最易觀測的植株外觀指標，并能反映植物所受脅迫的強度[14]。Cd脅迫嚴重影響了毛蔥的形態(tài)特征，使其株高、根長也受到明顯的抑制，外源Ca能有效緩解Cd對毛蔥幼苗產(chǎn)生的毒害，使其形態(tài)得到有效恢復(fù)、對其生長的抑制也明顯減弱(圖1，圖2)。因為Ca作為植物必需的營養(yǎng)元素之一，參與植物的多種生命活動與多種酶的代謝過程[15]，可在一定程度上緩解Cd的毒害，促進植物體的生長。

植株的生理代謝活性能夠反映環(huán)境對植物的適宜程度，含水量的高低是衡量植物生理活性的一個重要指標。采用植株鮮重(FW)與干重(DW)的比值代表植株的含水量。Cd造成毛蔥體內(nèi)含水量的顯著下降，造成體內(nèi)水分失衡(圖7)。植物對這一失衡關(guān)系的調(diào)節(jié)主要是通過相應(yīng)有機物的合成和無機離子的積累兩條途徑來實現(xiàn)[16- 19]。外源Ca促進了毛蔥根系的生長，保持了毛蔥體內(nèi)水分的相對平衡(圖7)，可能是由于外源Ca對根尖部位離子關(guān)系有明顯的改善，從而有利于根系生長[18,20](圖1)。Ca作為植物必需的營養(yǎng)元素之一，是多種酶的組成成分和激活劑，能調(diào)節(jié)細胞的充水度及滲透性，維持細胞正常的生理狀態(tài)，從而維持植物體的正常生理代謝，因此，Ca對于降低植物對Cd的吸收，及減輕Cd對植物的毒害具有重要作用[21]。

3.2 外源Ca對Cd 脅迫下毛蔥生理特性的影響

Cd 毒害造成植物的生理代謝紊亂，加速植物的衰老。有研究表明，葉片衰老過程中伴隨著葉綠素酶活性提高，葉綠素降解加劇。唐蕾等[22]采用反相高效液相色譜，結(jié)合光電二極管陣列和熒光檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在衰老的銀杏葉中主要存在葉綠素a、葉綠素b 和脫鎂葉綠素(暗橄欖褐色)，脫植基葉綠素(鮮綠色)。在液泡膜上也發(fā)現(xiàn)了一種依賴ATP(Adenosine Triphosphate, ATP)的特異運載蛋白，負責葉綠素代謝物在液泡中轉(zhuǎn)運[23]。由上可知，葉綠素的許多卟啉衍生物在葉片衰老過程中從衰老葉綠體轉(zhuǎn)運到液泡中貯存起來，這些葉綠素代謝物如脫植基葉綠素等的光譜性質(zhì)和葉綠素原體基本相同，可在同一波長下被檢測到，但這些葉綠素的代謝產(chǎn)物均不能行使正常葉綠素的功能，從而降低了葉片的光合特性。毛蔥受Cd毒害后其色素含量上升但其光合作用卻嚴重受到了抑制。葉綠素降解除了影響光合作用外還具有其它的意義。例如，衰老時葉綠素降解啟動蛋白質(zhì)的水解，利于氮的釋放利用；一些葉綠素降解產(chǎn)物或衍生物可以提高細胞對重金屬毒害的耐受力[24]。外源Ca對毛蔥幼苗色素含量產(chǎn)生較大影響。毛蔥葉片色素含量受外源Ca水平的限制，當外源Ca濃度為0.1 mmol/L時毛蔥葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量與Ca對照組相比均顯著下降，Ca濃度升至1 mmol/L時，色素含量繼續(xù)下降，但當Ca濃度為10 mmol/L時，其含量反而上升(低于無施加Ca組)。這可能與外源Ca促進了毛蔥的快速生長，其生長量增大導致的“稀釋效應(yīng)”有關(guān)[25]，但高濃度外源Ca(10 mmol/L)對毛蔥幼苗來說可能是一種營養(yǎng)脅迫，在這種營養(yǎng)脅迫下，Ca可能會造成強光脅迫，這與邱棟梁[26]的研究結(jié)果是一致的，即Ca能減少葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量的下降。類胡蘿卜素是葉綠體內(nèi)的天線色素，與光合作用中的光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)相連結(jié)，一方面阻止激發(fā)態(tài)葉綠素分子的激發(fā)能從反應(yīng)中心向外傳遞，另一方面又能保護葉綠素分子的激發(fā)能免遭光氧化損傷，是單線態(tài)氧重要的猝滅劑[27]，能夠在一定程度上保護光合機構(gòu)，調(diào)節(jié)過剩光能的耗散，減輕過剩光能對光合機構(gòu)的破壞。 因此，毛蔥葉片在10 mmol/L外源Ca處理下保持了較高的類胡蘿卜素含量[25]。這也是其耐Cd的一種有效措施。

Cd能使毛蔥葉片的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)持續(xù)降低，外源Ca明顯減小了其降低幅度，使Pn維持在較高的水平(圖4)。這可能是由于Cd造成毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)失衡所致。Mn和Ca都是光合放氧復(fù)合物中的重要組成成分。Mn是植物必需營養(yǎng)元素，與其體內(nèi)許多酶的活性和氧化還原體系有關(guān)，并直接參與光合作用[28]。Mn含量的下降而使葉綠體的放氧活性下降，從而抑制了毛蔥的光合效率[26]。而外源Ca能適當提高毛蔥的凈光合速率主要是因為Ca能提高葉綠體二氯酚吲哚酚(Dichlorophenol Indophenol, DCPIP)光還原活性。在PSⅡ膜中，每個PSⅡ含有一個高親合性及兩個低親合性的Ca的結(jié)合位點；這些位點上含有2—3個結(jié)合態(tài)Ca，并且非?？拷麺n復(fù)合物[29]，Ca能提高葉綠體DCPIP光還原活性可能是因為Ca促進Mn簇電子向原初氧化劑傳遞。已有研究證明Ca的作用位于Mn的S1—S4(不同氧化還原狀態(tài)的放氧復(fù)合體)狀態(tài)之后，接近原初氧化劑Y+，且促進Y+的還原[30]。Handreck[31]認為，Ca供應(yīng)過多會引起植物出現(xiàn)缺Mg的癥狀，這與本文的研究結(jié)果是一致的(表2)。肖細元等[27]也指出Ca處理顯著限制Mg的吸收，高鈣處理使蜈蚣草羽片中鎂濃度含量極低，幾乎為對照處理的一半。Mg和Mn一樣在植物的光合作用中發(fā)揮著重要的作用，Mg是葉綠素的重要組成成分，同時Mg也是催化磷酸化過程酶的關(guān)鍵輔助因子之一，在磷酸鹽的代謝過程中起著重要的作用[32]。因此，Mg的缺乏也可造成植物凈光合速率的顯著下降。

在Cd脅迫下毛蔥體內(nèi)Zn、Fe和Ca等半徑與Cd相似的離子含量均有所上升，因為Fe是植物體某些酶的組成成分，在氧化還原過程中起著重要的電子傳遞作用，而Zn與植物蒸騰作用有關(guān)，Zn還參與植物生長素的形成，促進光合作用和蛋白質(zhì)合成[27]。這些離子與Cd競爭毛蔥細胞表面有限的離子通道，進而減少毛蔥對Cd的吸收，從而減輕Cd毒害，另一方面，F(xiàn)e、Zn含量的增加進一步保證了毛蔥的正常生理，從而有利于毛蔥光合作用的提高。另外有研究報道，Zn含量的上升還可能是因為Zn與Ca之間存在共積累關(guān)系[33- 34]。Cd 脅迫所造成的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，影響植物正常的生理代謝[35- 36]，導致植物生物量下降[37]。外源Ca能緩解Cd的毒害，因為Ca與Cd具有相似的化學性質(zhì)，是Cd吸附位點的主要競爭者，當溶液中Ca和Cd同時存在時，Ca可顯著地降低植物對Cd的吸收和積累，從而減輕Cd的毒害。植物所處環(huán)境中的離子的物理性質(zhì)(化學價、離子半徑)的相似性會影響植物對離子的吸收及分配，如Cd能夠利用Ca2+通道被植物運輸，運Fe載體也參與Cd的運輸[38- 40]。另有研究指出，在Cd脅迫下，外源Ca使細胞內(nèi)游離Ca常常顯著增加，以便于啟動特定基因的表達，激活一系列生化反應(yīng)，從而使植物適應(yīng)環(huán)境中的脅迫因子[39- 48]。

4 結(jié)論

(1)不同濃度外源Ca 對Cd脅迫下的毛蔥處理12 d后，對Cd脅迫所造成的傷害具有不同程度的緩解作用。其中，10 mmol/L的外源Ca對毛蔥生長的緩解作用最為顯著。

(2)外源Ca對 Cd 脅迫下毛蔥葉片光合色素含量的影響。Cd脅迫毛蔥12 d后能導致其葉綠素a含量的顯著增加，處理組與對照組之間差異顯著(P<0.05)。不同濃度外源Ca 對葉綠素a的增加幅度有明顯的影響。1 mmol/L Ca有效的緩解了300 μmol/L Cd處理組毛蔥葉片葉綠素a含量的驟升；10 mmol/L Ca使10 μmol/L Cd處理毛蔥葉片葉綠素a含量恢復(fù)到正常水平。

(3)外源Ca 對Cd脅迫下毛蔥葉片光合特性的影響。Cd脅迫毛蔥12 d后，10、100 μmol/L和300 μmol/L Cd處理毛蔥其葉片凈光和速率比對照組分別下降了24.2%、75.8% 和85.4%。外源Ca 對其下降幅度有明顯的影響。具體表現(xiàn)為，Ca 濃度為0.1 mmol/L時對Cd的毒害無明顯緩解作用；當Ca 濃度達1 mmol/L時可顯著緩解300 μmol/L Cd的毒害(P< 0.05)；當外源Ca濃度高達10 mmol/L時，比1 mmol/L有更好的緩解作用，對100 μmol/L和300 μmol/L Cd毒害均有明顯緩解作用。

(4)Cd處理后毛蔥體內(nèi)Cd含量顯著增加且與Cd濃度呈正相關(guān)性，但Cd在毛蔥根系中的積累量遠遠高于葉片中的含量。施加外源Ca顯著降低了Cd處理組中毛蔥根系和葉片中Cd的積累量(P<0.05)。與外源Ca 對毛蔥根系中Cd的積累的影響一致，毛蔥葉片中Cd的積累量隨著施加外源Ca 而明顯降低。

(5)Cd脅迫造成毛蔥體內(nèi)明顯的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，顯著降低毛蔥根中Mg、Mn，葉中Ca、Mg、Mn、Zn等元素的含量；卻顯著增加了毛蔥根中Ca、Fe、Zn，葉中Fe元素的含量，擾亂毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)；外源Ca削弱了Cd 脅迫所造成的礦質(zhì)元素失衡，穩(wěn)定了毛蔥體內(nèi)礦質(zhì)營養(yǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

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Effects of exogenous calcium (Ca) on tolerance ofAlliumcepavar.agrogarumL. to cadmium (Cd) stress

WANG Qiaoling，ZOU Jinhua，LIU Donghua，YUE Jieyu*

TianjinKeyLaboratoryofAnimalandPlantRegulation,TianjinNormalUniversity,Tianjin300387,China

Cadmium (Cd) pollution is one of the most extensive and harmful environmental problems worldwide. Recently, coastal water pollution by Cd and other heavy metals have been becoming more serious because of continuous economic development, including mining, urban traffic, burning of fossil fuels, and production of phosphate fertilizers. Calcium (Ca) is an essential macroelement that plays a crucial role in regulating plant growth and development. Moreover, Ca has been shown to alleviate heavy metal toxicity in many plants.Alliumcepais well known and commonly used in many laboratories primarily due to its many advantages, such as low cost, short test time, ease of storage and handling, large number of roots, and large cells with excellent chromosome conditions. In the present study, this plant was chosen as the experimental material to investigate whether the application of exogenous Ca can enhance the tolerance ofA.cepavar.agrogarumL. to Cd stress (10,100 μmol/L and 300 μmol/L). In addition, the effects of various concentrations of exogenous Ca application (0, 0.1, 1, and 10 mmol/L) on the vegetative growth, photosynthesis characteristics, Cd accumulation, and nutrient minerals ofA.cepavar.agrogarumL. under various concentrations of Cd stress (10 μmol/L to 300 μmol/L) were analyzed. This study showed the following results: (1) Excess Cd significantly inhibited the growth ofA.cepavar.agrogarumL., resulting in changes in morphological characteristics, such as stunted and bent root tips and darkened green leaves, whereas exogenous Ca significantly decreased the negative effects of Cd and alleviated growth inhibition inA.cepavar.agrogarumL. (2) Cd treatment greatly increased the chlorophyll contents and significantly decreased net photosynthetic rate, stomatal conductance, and transpiration rate, whereas exogenous application of Ca markedly alleviated the increase in photosynthetic pigments and significantly increased the net photosynthetic rate, stomatal conductance, and transpiration rate. (3) Cd stress induced substantial Cd accumulation, resulting in serious nutrient imbalance, such as the significant inhibition of absorption of Mg ( Magnesium ) and Mn (Manganese ) in roots and Ca, Mg, Mn, and Zn ( Zinc ) in leaves and a massive accumulation of Ca, Fe (Iron) and Zn in roots and Fe in leaves, whereas the exogenous addition of Ca significantly decreased Cd accumulation and effectively reversed the Cd-induced imbalance of nutrients inA.cepavar.agrogarumL. Therefore, supplementing exogenous Ca with an optimal concentration can effectively relieve the phytotoxicity of Cd stress toA.cepavar.agrogarumL. by decreasing excessive Cd accumulation, maintaining high levels of photosynthesis characteristics, and maintaining the balance of water content, photosynthetic pigments, and nutrient elements, among others.

Alliumcepavar.agrogarumL.; Cd; Ca; stress; tolerance

天津市高等學?？萍及l(fā)展計劃項目(20100606，20110603)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)計劃項目青年項目(12JCQNJC09700)；天津師范大學校級基金(52XB1105，52XS1210)

2013- 05- 06;

2013- 09- 18

10.5846/stxb201305060949

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yueshan1982@163.com

王巧玲，鄒金華，劉東華，岳潔瑜.外源鈣(Ca)對毛蔥耐鎘(Cd)脅迫能力的影響.生態(tài)學報,2014,34(5):1165- 1177.

Wang Q L，Zou J H，Liu D H，Yue J Y.Effects of exogenous calcium (Ca) on tolerance ofAlliumcepavar.agrogarumL. to cadmium (Cd) stress.Acta Ecologica Sinica,2014,34(5):1165- 1177.