趙文珍++何穎紅++王云濤++楊勇琴

【摘要】目的：為獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞。方法：采取兩種方法，取SD大鼠附睪上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行培養(yǎng)。結(jié)果：方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。結(jié)論：獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的基礎(chǔ)和條件。

【關(guān)鍵詞】SD大鼠；附睪上皮；原代細胞培養(yǎng)

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology，School of Basic Medicine，Dali University，Dali 671000，China

[Abstract]objective：To obtain good growth state，less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method：Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion，were made cell suspension and were cultured.Results：Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method；The culture results from the second method are good，the sperm less or no，cultured cells for the vast majority of epithelial cells，and the growth speed.Conclusion：To obtain good growth state conclusion，provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat；The epididymal epithelium；Primary cell culture

附睪是精子功能成熟的場所，也一直是胚胎學和生殖醫(yī)學的研究熱點之一。哺乳類動物睪丸產(chǎn)生的精子須經(jīng)過附睪后才能獲得受精能力，即精子從結(jié)構(gòu)的成形進入功能的成熟階段，其中重要的標志之一是精子運動能力的獲得。精子在不同區(qū)域的附睪組織運行中，附睪上皮的基因表達有很大差異，并且從附睪頭部至尾部精子運動能力逐漸增強[1]。因此，在研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能時，附睪上皮原代培養(yǎng)的細胞質(zhì)量尤為重要。本研究采取兩種方法，取SD大鼠附睪尾部上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行原代培養(yǎng)。為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。

資料與方法

實驗動物：雄性SD大鼠24只，年齡10～12周，購自大理學院動物房。隨機分為兩組，每組4只，每次實驗用兩組，重復3次。

主要試劑與儀器：①試劑：蛋白酶K，膠原酶IV，胰蛋白酶，青霉素/鏈霉素，胎牛血清，DMEM，戊巴比妥鈉，細胞培養(yǎng)皿，離心管等耗材。⑵儀器：水浴搖床，CO2培養(yǎng)箱，體視鏡，相差顯微鏡，5810R低溫離心機。

方法：①附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)方法一[2-3]：3.5%戊巴比妥鈉0.6～1.0ml麻醉SD大鼠，取附睪尾部反復剪碎，去除上清。膠原酶IV、胰蛋白酶消化，200目濾網(wǎng)過濾，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8h后觀察細胞生長情況，隔夜換液，5天左右細胞生長可達80%～90%融合。②附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)分法二[4]：麻醉和取材同方法一。解剖顯微鏡下取附睪管粗略剪碎。膠原酶IV消化后徹底剪碎附睪管，蛋白酶K消化后，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔夜換液，2～3天細胞生長可達80%～90%融合。

結(jié)果

兩種方法制作的細胞懸液結(jié)果：結(jié)果顯示：細胞懸液多為單個細胞，消化完全，其中方法一的懸液中精子較多，方法二的懸液中精子較少或無（圖1）。

圖1：細胞懸液（A：方法一；B：方法二；×100）

兩種方法培養(yǎng)的結(jié)果：結(jié)果顯示：方法一：成纖維細胞含量較多，上皮細胞較少；方法二：絕大部分為上皮細胞，細胞間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，具有連接成片的能力（圖2）。

圖2：附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞（A：方法一；B：方法二；×100）

討論

原代培養(yǎng)細胞的質(zhì)量是能否成功進行體外精子成熟相關(guān)因子研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。原代培養(yǎng)是指細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段，三個步驟：分離組織；解剖或解離組織塊；接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)有兩種方式：一種是將組織塊貼附于適宜的基質(zhì)中，細胞自組織塊向外遷移生長；一種是用機械法或酶消化法處理組織塊制成細胞懸液，黏附于基質(zhì)中生長。居于以上原理和方法，本研究在培養(yǎng)附睪尾部上皮細胞過程中，采取兩種方法進行培養(yǎng)，均以酶消化為主，制成細胞懸液，來進行培養(yǎng)。兩種方法相比較，方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。因此，通過兩種培養(yǎng)方法的比較，獲得了生長狀態(tài)佳，精子少的原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。同時，建立了附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞的方法，為其它實驗研究提供了穩(wěn)定的技術(shù)平臺。

參考文獻

[1]Amann RP，Hammerstedt RH，Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation：a perspective.Reproduction，fertility，and development，1993，5：361-381.

[2]Chen YC，Bunick D，Bahr JM，Klinefelter GR，Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell，1998 Feb；30（1）：1-13.

[3]Klinefelter GR，Amann RP，Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod，1982，26（5）：885-901.

[4]Reyes-Moreno C，Laflamme J，F(xiàn)renette G，Sirard MA，Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev，2008，75（3）：512-20.

【摘要】目的：為獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞。方法：采取兩種方法，取SD大鼠附睪上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行培養(yǎng)。結(jié)果：方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。結(jié)論：獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的基礎(chǔ)和條件。

【關(guān)鍵詞】SD大鼠；附睪上皮；原代細胞培養(yǎng)

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology，School of Basic Medicine，Dali University，Dali 671000，China

[Abstract]objective：To obtain good growth state，less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method：Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion，were made cell suspension and were cultured.Results：Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method；The culture results from the second method are good，the sperm less or no，cultured cells for the vast majority of epithelial cells，and the growth speed.Conclusion：To obtain good growth state conclusion，provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat；The epididymal epithelium；Primary cell culture

附睪是精子功能成熟的場所，也一直是胚胎學和生殖醫(yī)學的研究熱點之一。哺乳類動物睪丸產(chǎn)生的精子須經(jīng)過附睪后才能獲得受精能力，即精子從結(jié)構(gòu)的成形進入功能的成熟階段，其中重要的標志之一是精子運動能力的獲得。精子在不同區(qū)域的附睪組織運行中，附睪上皮的基因表達有很大差異，并且從附睪頭部至尾部精子運動能力逐漸增強[1]。因此，在研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能時，附睪上皮原代培養(yǎng)的細胞質(zhì)量尤為重要。本研究采取兩種方法，取SD大鼠附睪尾部上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行原代培養(yǎng)。為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。

資料與方法

實驗動物：雄性SD大鼠24只，年齡10～12周，購自大理學院動物房。隨機分為兩組，每組4只，每次實驗用兩組，重復3次。

主要試劑與儀器：①試劑：蛋白酶K，膠原酶IV，胰蛋白酶，青霉素/鏈霉素，胎牛血清，DMEM，戊巴比妥鈉，細胞培養(yǎng)皿，離心管等耗材。⑵儀器：水浴搖床，CO2培養(yǎng)箱，體視鏡，相差顯微鏡，5810R低溫離心機。

方法：①附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)方法一[2-3]：3.5%戊巴比妥鈉0.6～1.0ml麻醉SD大鼠，取附睪尾部反復剪碎，去除上清。膠原酶IV、胰蛋白酶消化，200目濾網(wǎng)過濾，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8h后觀察細胞生長情況，隔夜換液，5天左右細胞生長可達80%～90%融合。②附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)分法二[4]：麻醉和取材同方法一。解剖顯微鏡下取附睪管粗略剪碎。膠原酶IV消化后徹底剪碎附睪管，蛋白酶K消化后，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔夜換液，2～3天細胞生長可達80%～90%融合。

結(jié)果

兩種方法制作的細胞懸液結(jié)果：結(jié)果顯示：細胞懸液多為單個細胞，消化完全，其中方法一的懸液中精子較多，方法二的懸液中精子較少或無（圖1）。

圖1：細胞懸液（A：方法一；B：方法二；×100）

兩種方法培養(yǎng)的結(jié)果：結(jié)果顯示：方法一：成纖維細胞含量較多，上皮細胞較少；方法二：絕大部分為上皮細胞，細胞間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，具有連接成片的能力（圖2）。

圖2：附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞（A：方法一；B：方法二；×100）

討論

原代培養(yǎng)細胞的質(zhì)量是能否成功進行體外精子成熟相關(guān)因子研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。原代培養(yǎng)是指細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段，三個步驟：分離組織；解剖或解離組織塊；接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)有兩種方式：一種是將組織塊貼附于適宜的基質(zhì)中，細胞自組織塊向外遷移生長；一種是用機械法或酶消化法處理組織塊制成細胞懸液，黏附于基質(zhì)中生長。居于以上原理和方法，本研究在培養(yǎng)附睪尾部上皮細胞過程中，采取兩種方法進行培養(yǎng)，均以酶消化為主，制成細胞懸液，來進行培養(yǎng)。兩種方法相比較，方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。因此，通過兩種培養(yǎng)方法的比較，獲得了生長狀態(tài)佳，精子少的原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。同時，建立了附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞的方法，為其它實驗研究提供了穩(wěn)定的技術(shù)平臺。

參考文獻

[1]Amann RP，Hammerstedt RH，Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation：a perspective.Reproduction，fertility，and development，1993，5：361-381.

[2]Chen YC，Bunick D，Bahr JM，Klinefelter GR，Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell，1998 Feb；30（1）：1-13.

[3]Klinefelter GR，Amann RP，Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod，1982，26（5）：885-901.

[4]Reyes-Moreno C，Laflamme J，F(xiàn)renette G，Sirard MA，Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev，2008，75（3）：512-20.

【摘要】目的：為獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞。方法：采取兩種方法，取SD大鼠附睪上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行培養(yǎng)。結(jié)果：方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。結(jié)論：獲得生長狀態(tài)佳，精子少的附睪上皮原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的基礎(chǔ)和條件。

【關(guān)鍵詞】SD大鼠；附睪上皮；原代細胞培養(yǎng)

Study on primary cultured SD rat epididymal epithelial cell culture methods of different

Zhao Wenzhen He YingHong Wang YunTao Yang YongQin

Department of Histology and Embryology，School of Basic Medicine，Dali University，Dali 671000，China

[Abstract]objective：To obtain good growth state，less sperm epididymal epithelial cells in primary culture.Method：Adopt two kinds of methods.The epididymal epithelial tissues of SD rats were mainly made by enzyme digestion，were made cell suspension and were cultured.Results：Cultured fibroblasts accounted for a large proportion from the first method；The culture results from the second method are good，the sperm less or no，cultured cells for the vast majority of epithelial cells，and the growth speed.Conclusion：To obtain good growth state conclusion，provides the basis and conditions necessary for the study of epididymis and sperm function maturation and fertilization of the key molecules associated function.

[Key words]SD rat；The epididymal epithelium；Primary cell culture

附睪是精子功能成熟的場所，也一直是胚胎學和生殖醫(yī)學的研究熱點之一。哺乳類動物睪丸產(chǎn)生的精子須經(jīng)過附睪后才能獲得受精能力，即精子從結(jié)構(gòu)的成形進入功能的成熟階段，其中重要的標志之一是精子運動能力的獲得。精子在不同區(qū)域的附睪組織運行中，附睪上皮的基因表達有很大差異，并且從附睪頭部至尾部精子運動能力逐漸增強[1]。因此，在研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能時，附睪上皮原代培養(yǎng)的細胞質(zhì)量尤為重要。本研究采取兩種方法，取SD大鼠附睪尾部上皮組織，均以酶消化為主，制成細胞懸液，進行原代培養(yǎng)。為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。

資料與方法

實驗動物：雄性SD大鼠24只，年齡10～12周，購自大理學院動物房。隨機分為兩組，每組4只，每次實驗用兩組，重復3次。

主要試劑與儀器：①試劑：蛋白酶K，膠原酶IV，胰蛋白酶，青霉素/鏈霉素，胎牛血清，DMEM，戊巴比妥鈉，細胞培養(yǎng)皿，離心管等耗材。⑵儀器：水浴搖床，CO2培養(yǎng)箱，體視鏡，相差顯微鏡，5810R低溫離心機。

方法：①附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)方法一[2-3]：3.5%戊巴比妥鈉0.6～1.0ml麻醉SD大鼠，取附睪尾部反復剪碎，去除上清。膠原酶IV、胰蛋白酶消化，200目濾網(wǎng)過濾，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8h后觀察細胞生長情況，隔夜換液，5天左右細胞生長可達80%～90%融合。②附睪尾部上皮原代細胞培養(yǎng)分法二[4]：麻醉和取材同方法一。解剖顯微鏡下取附睪管粗略剪碎。膠原酶IV消化后徹底剪碎附睪管，蛋白酶K消化后，重懸液相差顯微鏡下觀察消化情況及細胞數(shù)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔夜換液，2～3天細胞生長可達80%～90%融合。

結(jié)果

兩種方法制作的細胞懸液結(jié)果：結(jié)果顯示：細胞懸液多為單個細胞，消化完全，其中方法一的懸液中精子較多，方法二的懸液中精子較少或無（圖1）。

圖1：細胞懸液（A：方法一；B：方法二；×100）

兩種方法培養(yǎng)的結(jié)果：結(jié)果顯示：方法一：成纖維細胞含量較多，上皮細胞較少；方法二：絕大部分為上皮細胞，細胞間緊密相靠、互相銜接，呈“鋪路石”狀，具有連接成片的能力（圖2）。

圖2：附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞（A：方法一；B：方法二；×100）

討論

原代培養(yǎng)細胞的質(zhì)量是能否成功進行體外精子成熟相關(guān)因子研究的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。原代培養(yǎng)是指細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段，三個步驟：分離組織；解剖或解離組織塊；接種于培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)有兩種方式：一種是將組織塊貼附于適宜的基質(zhì)中，細胞自組織塊向外遷移生長；一種是用機械法或酶消化法處理組織塊制成細胞懸液，黏附于基質(zhì)中生長。居于以上原理和方法，本研究在培養(yǎng)附睪尾部上皮細胞過程中，采取兩種方法進行培養(yǎng)，均以酶消化為主，制成細胞懸液，來進行培養(yǎng)。兩種方法相比較，方法一：制成的細胞懸液中有較多的精子存在，培養(yǎng)的細胞中成纖維細胞占較大比例；方法二：培養(yǎng)結(jié)果比較好，精子少或無，培養(yǎng)的細胞中絕大部分為上皮細胞，且生長速度較快。因此，通過兩種培養(yǎng)方法的比較，獲得了生長狀態(tài)佳，精子少的原代培養(yǎng)細胞，為研究附睪上皮中與精子功能成熟和受精相關(guān)的關(guān)鍵分子功能提供了必要的條件。同時，建立了附睪尾部上皮原代培養(yǎng)細胞的方法，為其它實驗研究提供了穩(wěn)定的技術(shù)平臺。

參考文獻

[1]Amann RP，Hammerstedt RH，Veeramachaneni DN.The epididymis and sperm maturation：a perspective.Reproduction，fertility，and development，1993，5：361-381.

[2]Chen YC，Bunick D，Bahr JM，Klinefelter GR，Hess RA.Isolation and culture of epithelial cells from rat ductuli efferentes and initial segment epididymidis.Tissue Cell，1998 Feb；30（1）：1-13.

[3]Klinefelter GR，Amann RP，Hammerstedt RH.Culture of principal cells from the rat caput epididymidis.Biol Reprod，1982，26（5）：885-901.

[4]Reyes-Moreno C，Laflamme J，F(xiàn)renette G，Sirard MA，Sullivan R.Spermatozoa modulate epididymal cell proliferation and protein secretion in vitro.Mol Reprod Dev，2008，75（3）：512-20.