齊元富，鄭祎，黃利敏

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

肺癌嚴(yán)重威脅人類生命和健康，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。我國(guó)肺癌病死率在城市已居腫瘤死亡首位，對(duì)肺癌的防治研究成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的科研課題。六神丸方的組成包括麝香、牛黃、冰片、珍珠、制蟾酥、明雄黃，有清熱解毒，消腫止痛的功效。筆者在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)六神丸能明顯改善中晚期肺癌患者的生存質(zhì)量，穩(wěn)定瘤灶，控制轉(zhuǎn)移，減輕化療的毒副作用［1］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討六神丸治療肺癌的作用機(jī)制。

1 材料

實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞株、藥物、試劑及儀器參見(jiàn)本課題組前期研究結(jié)果［2－5］。用適量生理鹽水將研磨碎的六神丸溶解至實(shí)驗(yàn)所需濃度(8.4mg/kg)，在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將35只SD大鼠(雄性，體質(zhì)量200g左右)隨機(jī)分為對(duì)照組和觀察組，其中對(duì)照組10只，觀察組25只。觀察組每日灌胃2次，每次給予六神丸溶液4ml，對(duì)照組每日給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)3天。末次灌胃(灌藥前禁食12h)后1h用戊巴比妥鈉將其麻醉，從后腹主動(dòng)脈及心室采血，無(wú)菌分離血清，滅活除菌后分裝入小瓶，保存于－20℃。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及懸液制備

常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約80% 時(shí)進(jìn)行傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液配制成1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(10%正常鼠血清組)和觀察組，觀察組再分為六神丸含藥血清組、順鉑(DDP)組(DDP:1μg/ml)及DDP+六神丸聯(lián)合組，其中六神丸含藥血清組和聯(lián)合組再分為5%、10%、15%、20%、25%五個(gè)梯度濃度組，共12組，每組再設(shè)8個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞懸液接種于96孔平底培養(yǎng)板中，每孔加入200μl，調(diào)零孔組為右下方剩余孔。將各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后，去掉原培養(yǎng)液，加入各濃度含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h加入濃度為5mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄液，再加入二甲基亞砜(DMDSO)200μl/孔，震蕩5min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490nm處檢測(cè)OD值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均OD值。生長(zhǎng)抑制率IR(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值/空白對(duì)照平均OD值)×100%。

2.3 免疫組化法檢測(cè)VEGF表達(dá)

將A549細(xì)胞懸液接種于經(jīng)過(guò)高溫消毒的蓋玻片，并放入6孔板內(nèi)，待細(xì)胞爬滿玻片后棄培養(yǎng)液，加入不同濃度的血清及實(shí)驗(yàn)藥物，再繼續(xù)培養(yǎng)24h。后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒操作，封片后，將各組免疫組化片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞即胞質(zhì)、胞核和胞膜為棕黃色顆粒者，選擇陽(yáng)性細(xì)胞較集中的區(qū)域，采集5個(gè)光鏡視野輸入到高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)中，進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析。

2.4 RT－PCR法檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、5%、10%、15%含藥鼠血清組、DDP組及DDP+10%含藥鼠血清組，收集各組細(xì)胞，按總RNA抽提試劑盒操作步驟提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)分光光度儀測(cè)定 RNA濃度和純度，A260/A280均在1.8～2.0之間，可以繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。取3μg總RNA于42℃逆轉(zhuǎn)錄1h后，以內(nèi)參照基因(β－actin)作為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行半定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。VEGF:上游 5－TCGGGCCTCCGAAA －CCATGA －3'，下游5'－CCTGGTGAGAGATCTGGTTC －3'，基因片斷長(zhǎng)度為:516bp、648bp、720bp、771bp。β － actin:上游 5'－CGCTGCGCT－GGTCGTCGACA －3'，下游 5'－GTCACGCACGATTTC2CGCT－3'，基因片斷長(zhǎng)度為500bp。引物均由上海生物工程有限公司合成。取RT產(chǎn)物5μl，進(jìn)行 PCR 反應(yīng):95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃ ～60℃復(fù)性 1min，72℃延伸 1min，共 30 個(gè)循環(huán)。采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)攝取圖像，結(jié)果以目的條帶與對(duì)應(yīng)的β－actin密度比值表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 六神丸對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六神丸含藥血清能一定程度上抑制A549細(xì)胞增殖(5%藥血清組與對(duì)照組相比P＞0.05，其余含藥血清組、DDP及聯(lián)合組與對(duì)照組相比P＜0.05)，抑制作用隨血藥濃度增高而增強(qiáng);DDP與六神丸含藥血清合用，對(duì)抑制細(xì)胞增殖有明顯的協(xié)同作用(P ＜0.05)。

3.2 六神丸對(duì)A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)表1，圖1。各含藥鼠血清組、DDP組及聯(lián)合組的VEGF表達(dá)明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.05或0.01);VEGF表達(dá)量與六神丸濃度負(fù)相關(guān);同時(shí)結(jié)果顯示聯(lián)合組的抑制作用更顯著，表明二者合用有協(xié)同作用。

表1 六神丸含藥血清對(duì)A549細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響(s)

表1 六神丸含藥血清對(duì)A549細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響(s)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 DDP組相比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 視野(n)平均光密度 平均灰度5 0.3069 ±0.03434 164.7 ±15.36 5%含藥鼠血清組 5 0.2510±0.03196＊△△ 150.5±13.82△△10%含藥鼠血清組 5 0.2035±0.04562＊＊△△ 123.3 ±10.24＊＊△△15%含藥鼠血清組 5 0.1637±0.02199＊＊ 109.5±16.34＊＊DDP 組 5 0.1546±0.02130＊＊ 101.4 ±8.944＊＊DDP+10%含藥鼠血清組 5 0.1007±0.0259＊＊△△ 85.8±10.20對(duì)照組＊＊△△

圖1 六神丸對(duì)A549細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響

3.3 六神丸對(duì)A549細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各含藥鼠血清組、DDP組及聯(lián)合組的VEGF mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組，有顯著性差異(P＜0.01)，表明VEGF mRNA表達(dá)量與六神丸的濃度成反比;聯(lián)合組對(duì)VEGF mRNA表達(dá)的抑制作用更顯著，表明DDP對(duì)六神丸的抑制作用有協(xié)同效果。

表2 六神丸含藥血清對(duì)A549細(xì)胞VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量(s)

表2 六神丸含藥血清對(duì)A549細(xì)胞VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量(s)

注:與對(duì)照組相比，＊＊P ＜0.01;與 DDP組相比，△△P ＜0.01。

組別 n RATIO(%)77.53 ±14.70 5%含藥鼠血清組 6 65.96 ±10.63＊＊△△10%含藥鼠血清組 6 52.87 ±5.82＊＊△△15%含藥鼠血清組 6 41.22 ±3.18＊＊DDP 組 6 40.04 ±4.37＊＊DDP+10%含藥鼠血清組 6 26.10 ±4.13對(duì)照組6＊＊△△

圖2 六神丸對(duì)A549細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

4 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種由腫瘤細(xì)胞分泌的具有促進(jìn)血管生成作用的重要細(xì)胞因子，它功能強(qiáng)大且能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，屬于血小板衍生生長(zhǎng)因子超家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的VEGF相關(guān)基因家族包括6個(gè)分泌型的糖蛋白，分別為 VEGF－A，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D，VEGF－E和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placentagrowth factor，PDGF)－land －2［6－9］。研究表明，VEGF 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞滲透、激活、存活、增殖、浸潤(rùn)和遷移，與腫瘤血管生成密切相關(guān)［10－13］。血管的生成對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起著重要作用，因此，抑制VEGF途徑被確認(rèn)為是一種重要的、有效的抗癌模式。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，六神丸含藥血清能一定程度抑制人肺癌A549細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，與藥物濃度呈正相關(guān)，且與順鉑有協(xié)同作用。本研究通過(guò)免疫組化法及RT－PCR法檢測(cè)六神丸作用于人肺癌A549細(xì)胞對(duì)VEFG表達(dá)的影響，結(jié)果證實(shí)六神丸可顯著下調(diào)人肺癌A549細(xì)胞VEGF的表達(dá)，這可能是六神丸抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，六淫外侵、飲食不節(jié)、五志過(guò)極等皆可于體內(nèi)形成熱毒，熱毒灼傷陰津，煉液為痰，久而成瘀，阻滯于肺而發(fā)為肺癌?？梢?jiàn)肺癌形成的重要病機(jī)之一即是“毒聚”。所以采用以毒攻毒治法，借助有毒之品的峻猛之力攻邪以消除毒聚。本實(shí)驗(yàn)選取作為攻毒法代表方藥的六神丸從細(xì)胞及分子水平探索六神丸抗肺癌作用及其可能的分子機(jī)制，為其今后用于肺癌的治療提供科學(xué)依據(jù)。

［1］齊元富，鄭祎，侯倩倩.六神丸以毒攻毒治療非小細(xì)胞肺癌臨床研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2013，40(1):6 －7.

［2］黃利敏.六神丸抗肺癌血管生成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的實(shí)驗(yàn)及臨床研究［D］.濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012:3－6.

［3］齊元富，李慧杰，劉寨東.納米雄黃對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖影響及其機(jī)制的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2013，20(1):27 －30.

［4］劉寨東.雄黃納米化后誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞株凋亡及抗血管生成的體外研究［D］.濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué)，2011:3－5.

［5］于連洋.納米雄黃干預(yù)肺癌A549細(xì)胞對(duì)VEGF及HIF－1表達(dá)的影響［D］.濟(jì)南:山東中醫(yī)藥大學(xué)，2012:2－3.

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