郭樂，周賽男，藺曉源，易健，郭純，劉柏炎，蔡光先

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)省部共建中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410007)

腦血管疾病患者輕則遺留殘疾，重則失去生命，絕大多數(shù)需終生治療，讓醫(yī)者在治療上感到非常棘手。我國每年治療費(fèi)用中用于腦卒中多達(dá)數(shù)百億元，缺血性腦血管病(ICVD)占用其中很大一部分。近些年，腦缺血后大腦炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制方面的研究受到重視，其中核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)在腦梗死等非病原微生物性炎癥損傷中的作用引起了學(xué)術(shù)界的關(guān)注［1］。補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦缺血炎癥反應(yīng)抗炎效果明顯，抗炎機(jī)制受到關(guān)注，因此深入研究補(bǔ)陽還五湯是如何有效的減輕炎癥損傷的作用機(jī)制有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)陽還五湯作為研究對(duì)象，探討了補(bǔ)陽還五湯多時(shí)間點(diǎn)長時(shí)間段對(duì)ICVD神經(jīng)功能的保護(hù)作用，并觀察其對(duì)腦缺血后NF－κB的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(280±20)g，共180只，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(湘)2009－0004，動(dòng)物合格證號(hào):004535。

1.1.2 藥物 補(bǔ)陽還五湯處方來源于王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)》，處方組成:黃芪 120g，當(dāng)歸 6g，赤芍4.5g，芍藥 3g，地龍 3g，紅花 3g，桃仁 3g。藥材購自湖南省藥材公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院鑒定均符合《中國藥典》有關(guān)規(guī)定。補(bǔ)陽還五湯的制備:先用清水浸泡30min，第一煎加藥材5倍體積的蒸餾水，煎汁30min，第二煎5倍體積蒸餾水，煎汁30min，兩煎混合，濃縮至含生藥2g/mL，冷藏備用。米諾環(huán)素(惠氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號(hào) H10960010，批號(hào)2009077)。

1.1.3 主要試劑 水合氯醛(中國上海白鶴化工廠);鼠抗鼠NF－κB/p50單克隆抗體(abcam公司);PDTC(吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽，美國sigma公司);DMSO(二甲基亞砜，北京索萊寶有限公司);PDTC用DMSO溶解，再用生理鹽水稀釋;AEC顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);SABC試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4 主要儀器 自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海玻璃儀器一廠);ZD－600電熱恒溫水浴箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠);BX5l光學(xué)顯微鏡和IPP5.1圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus公司);FA型電子天平(上海臺(tái)之衡電子衡器有限公司);E60冰凍切片機(jī)(英國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將動(dòng)物隨機(jī)分為空白組，假手術(shù)組，模型組、PDTC+模型組、補(bǔ)陽還五湯+模型組，米諾環(huán)素+模型組，共6組。每組30只，給予不同處理。

1.2.2 模型建立 參照Longa報(bào)道［2］的方法，采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法(MCAO)復(fù)制局灶性腦缺血模型。術(shù)后動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物于清醒后2h參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值在1～3分者入組，死亡等原因剔除的動(dòng)物隨機(jī)替補(bǔ)。假手術(shù)組僅作皮膚切開及血管剝離后隨即縫合，不做栓線處理。

1.2.3 給藥 動(dòng)物術(shù)后開始給藥，補(bǔ)陽還五湯，米諾環(huán)素均按成人與動(dòng)物體表面積折算，補(bǔ)陽還五湯大鼠以體質(zhì)量 250g計(jì)算為 5g/(kg·d)，米諾環(huán)素為2.35g/(kg·d)，加蒸餾水按相同的灌胃體積配制各濃度藥液，每日灌胃1次。模型組和假手術(shù)組動(dòng)物均給予等體積蒸餾水。PDTC按100mg/(kg·d)確定給藥量，腹腔注射。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分 參照文獻(xiàn)［3］5級(jí)評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分。無神經(jīng)損傷癥狀，0分;不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，1分;向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，2分;向?qū)?cè)傾倒，3分;不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，4分。各組動(dòng)物在處死前2h進(jìn)行評(píng)分。

1.2.4.2 免疫組化檢測(cè) 手術(shù)后7、14、21天處死大鼠，10%水合氯醛麻醉后，灌注取腦，然后放入蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水，運(yùn)用單標(biāo)酶學(xué)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)NF－κB/P50表達(dá)。將染好的切片在顯微鏡下觀察并拍照。每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野(×400)，分別計(jì)數(shù)各視野的陽性細(xì)胞數(shù)，并取其均值作為每組樣本的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnet’s T3法檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 假手術(shù)組無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀。經(jīng)過造模后模型組、各用藥組共死亡30只，同時(shí)隨機(jī)替補(bǔ)。用藥7天、14天、21天后，模型組的神經(jīng)功能評(píng)分較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.01)。補(bǔ)陽還五湯組、米諾環(huán)素組、PDTC組神經(jīng)功能評(píng)分與模型組比較明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，但其組間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能癥狀評(píng)分的影響(s，n=10)

表1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能癥狀評(píng)分的影響(s，n=10)

注:與模型組比較，#P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 7天 14天 21天0.00 ±0.00假手術(shù)組 0.00 ±0.00▲模型組 1.33 ±0.21 1.13 ±0.13 1.25 ±0.16補(bǔ)陽還五湯組 0.50 ±0.22# 0.63 ±0.18# 0.50 ±0.19▲米諾環(huán)素組 0.67±0.33# 0.50±0.19▲ 0.63±0.18▲PDTC 組 0.67 ±0.21# 0.63 ±0.18# 0.71 ±0.18正常組#

2.2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，NF－κB/p50蛋白在細(xì)胞核、胞漿內(nèi)均有表達(dá)，表達(dá)部位染色呈現(xiàn)棕紅色，細(xì)胞核為圓形或橢圓形。正常組與假手術(shù)組可見少量NF－κB/p50陽性細(xì)胞表達(dá)，陽性細(xì)胞于各腦區(qū)散在分布。腦缺血后即可見NF－κB/p50蛋白陽性細(xì)胞大量增加，主要集中在梗死周圍區(qū)、海馬回區(qū)或皮質(zhì)，密集分布。補(bǔ)陽還五湯組、米諾環(huán)素組、PDTC組7天、14天、21天各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)依次減少，與模型組比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或P＜0.01);7天、14天各用藥組間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而21天組，補(bǔ)陽還五湯組與PDTC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50陽性細(xì)胞數(shù)的影響(s，n=6)

表2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50陽性細(xì)胞數(shù)的影響(s，n=6)

注:與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與補(bǔ)陽還五湯組比較，☆P ＜0.05。

組別 7天 14天 21天正常組 36.17 ±5.83▲ 33.83 ±5.43▲ 40.50 ±4.11▲假手術(shù)組 34.33±7.34▲ 42.67±6.98▲ 37.50±4.98▲模型組 271.83 ±27.62 234.00 ±17.99 128.67 ±10.46補(bǔ)陽還五湯組 145.00 ±13.14# 71.33 ±10.53▲ 35.83 ±7.10▲米諾環(huán)素組 128.83 ±6.95# 70.67 ±9.64▲ 43.83 ±7.06▲PDTC 組 132.50 ±9.76# 69.17 ±6.85▲ 57.00 ±2.96▲☆

3 討論

根據(jù)ICVD的臨床癥狀，可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”的范疇。補(bǔ)陽還五湯主要治療氣虛血瘀型中風(fēng)，關(guān)于其能促進(jìn)腦梗死患者的神經(jīng)功能康復(fù)臨床報(bào)道亦不少見［4］。實(shí)驗(yàn)研究方面證實(shí)，其能通過多種途徑對(duì)抗 ICVD 的不良損傷［5］，本課題組前期研究［6－8］也證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)缺血腦組織的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，大腦海馬區(qū)增殖明顯，還可通過影響腦缺血后移植神經(jīng)干細(xì)胞的存活及分化，從而加快腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。近些年，腦缺血后大腦炎癥反應(yīng)的研究受到重視，補(bǔ)陽還五湯在腦缺血后炎癥反應(yīng)方面的作用機(jī)制研究逐漸受到關(guān)注，且其抗炎效果顯著，有待進(jìn)一步揭示。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)14天MCAO大鼠腦組織NF－κB/p50免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

NF－κB［9］是 Rel蛋白家族中的一組重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過程中發(fā)揮著重要的作用［1］。它主要以Rel家族蛋白亞基組成的同源或異源性二聚體的形式存在，目前最多的就是由多肽鏈p50和p65形成的異源性二聚體。Blondeau等研究表明，局灶性腦缺血模型動(dòng)物經(jīng)過缺血預(yù)處理后，可誘導(dǎo)缺血耐受，表現(xiàn)出NF－κB表達(dá)受到抑制，大腦缺血梗死灶體積縮小，從而減輕了神經(jīng)功能缺損［10］。NF－κB通路與腦缺血后炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切，報(bào)道越來越多，研究也越來越具體，針對(duì)腦缺血損傷后炎癥反應(yīng)的NF－κB信號(hào)通路的研究也成為目前開發(fā)治療ICVD新藥的研究靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將NF－κB信號(hào)通路中的NF－κB/p50因子作為研究對(duì)象深入揭示補(bǔ)陽還五湯治療腦缺血的作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽還五湯組、米諾環(huán)素組、PDTC組7天、14天、21天各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分均較模型組明顯減小，而其組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述用藥組各時(shí)間點(diǎn)NF－κB/p50陽性細(xì)胞數(shù)減少，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且補(bǔ)陽還五湯21天組與PDTC組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說明，補(bǔ)陽還五湯可能通過調(diào)節(jié)NF－κBp/50蛋白表達(dá)，從而達(dá)到減輕神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷而起到腦保護(hù)作用。由此推測(cè)，補(bǔ)陽還五湯和米諾環(huán)素，PDTC一樣能通過調(diào)節(jié)NF－κB信號(hào)通路來抑制腦缺血損傷的炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能。

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