李松巖,張宸豪,李文平,李 妍*

(1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013;2.吉林司法警官職業(yè)學院，吉林 長春 130216)

·論 著·

NCTD和IFN-γ對Jurkat細胞mTRAIL表達的影響

李松巖1，2,張宸豪1,李文平1,李 妍1*

(1.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013;2.吉林司法警官職業(yè)學院，吉林 長春 130216)

目的 研究NCTD和IFN-γ對T細胞Jurkat TRAIL 表達的影響。方法 培養(yǎng)Jurkat,用不同濃度的IFN-γ和NCTD處理細胞，流式細胞術分析細胞表面TRAIL表達和細胞內(nèi)活性氧水平。結(jié)果 IFN-γ以濃度依賴的方式上調(diào)Jurkat細胞TRAIL表達，而NCTD可增強IFN-γ對TRAIL的上調(diào)效應；NCTD可增加細胞內(nèi)活性氧的表達。結(jié)論 NCTD可能通過活性氧調(diào)節(jié)的信號途徑協(xié)同IFN-γ增強TRAIL的表達。

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體;去甲斑蝥素;活性氧

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL) 可表達于免疫效應細胞和部分腫瘤細胞表面。膜型TRAIL(membrane-bounding TRAIL,mTRAIL)及重組TRAIL(recombinant TRAIL,rTRAIL)均能選擇性誘導腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞凋亡,而赦免正常細胞[1-2]。新近證實，金屬蛋白酶家族成員參與 TRAIL 的酶切脫落,成為可溶型TRAIL(soluble TRAIL,sTRAIL)。病毒感染、腫瘤、自身免疫病等疾病情況下，血清中 sTRAIL 含量增加。經(jīng)干擾素 (interferons，IFNs)誘導后的中性粒細胞、淋巴細胞和腫瘤細胞也可釋放sTRAIL，但mTRAIL表達減少。雖然重組的TRAIL蛋白和脫落sTRAIL被證實可誘導腫瘤細胞凋亡，但mTRAIL殺傷腫瘤的效應更強。去甲斑蝥素(norcanthar idin,NCTD) 是中藥斑蝥的有效成分[3]。近年發(fā)現(xiàn)，NCTD具有誘導細胞分化的作用，是否可調(diào)節(jié)mTRAIL的表達未見報道，本研究以人T細胞Jurkat為模型，分析NCTD和IFN-γ對mTRAIL表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

Jurkat保存于液氮中。PE標記鼠抗人TRAIL、重組IFN-γ購自eBioscinece公司(美國),NCTD 購自國家標準物質(zhì)中心?；钚匝跆结橂p氯熒光黃乙酸乙酯(Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)購自碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

實驗前1周復蘇細胞，以含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗，用培養(yǎng)液調(diào)細胞密度為3×105/mL,按10mL/孔接種于培養(yǎng)瓶。加入不同濃度NCTD(0.025、0.05和0.1 μmol/L)和NCTD(0和7.5μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，收集細胞。

1.3 TRAIL表達分析

收集細胞，PBS洗滌2次后，調(diào)為密度2×106/mL的細胞懸液。取200 μL細胞懸液，加入2 μL PE標記鼠抗人TRAIL抗體,對照組加入PE標記同型對照抗體；震蕩混勻后室溫避光反應30 min；PBS洗滌2次后重懸于500 μL PBS；立即用流式細胞儀分析。

1.4 細胞內(nèi)活性氧檢測

收集細胞，用PBS調(diào)為密度2×106/mL的細胞懸液，取500 μL細胞懸液，加入DCFH-DA儲存液，至其終濃度為5 μmol/L，混勻后在37 ℃避光反應30 min，PBS 洗2次后用流式細胞儀分析。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD和IFN-γ對mTRAIL表達的影響

不同濃度 NCTD和IFN-γ誘導16 h后，流式細胞術分析Jurkat細胞膜表面 TRAIL表達，取3次試驗TRAIL陽性表細胞百分率的均值(表1)。IFN-γ以濃度依賴的方式上調(diào)mTRAIL的表達，當NCTD與IFN-γ聯(lián)合作用后，mTRAIL表達進一步增加。

表 1 IFN-γ和NCTD對mTRAIL表達的影響(%)

*與IFN-γ單獨作用組比較，P<0.05

2.2 NCTD和IFN-γ對細胞內(nèi)活性氧水平的影響

ROS探針DCFH-DA 進入細胞后被酯酶水解為DCFH，后者被氧化后生成黃綠色熒光物質(zhì)，采用流式細胞儀檢測其熒光值則代表細胞內(nèi)ROS相對含量(表2)。

3 討 論

NCTD是斑蝥的主要藥效成分，其殺傷腫瘤細胞主要機制為抑制細胞有絲分裂和誘導細胞凋亡。有

表 2 IFN-γ和NCTD對ROS含量的影響

*與IFN-γ單獨作用組比較，P<0.05

學者報道，NCTD具有誘導細胞分化、阻止腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用。此外，NCTD還能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關的應激途徑，影響腫瘤細胞對其他化療藥物敏感性的效應[4-5]。ROS可激活JNK激酶，因此ROS/JNKs 是細胞內(nèi)重要的應激信號轉(zhuǎn)導通路。JNKs通過對下游轉(zhuǎn)錄因子磷酸化的調(diào)節(jié)，影響細胞膜和細胞內(nèi)凋亡相關靶分子的表達；NCTD可能通過ROS/JNK途徑上調(diào)mTRAIL表達[6]。但其通過哪種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)TRAIL表，以及mTRAIL的增加是否與NCTD對金屬蛋白酶表達和活性相關，還需要進一步研究。

[1] 李 妍,金伯泉.可溶型細胞因子受體產(chǎn)生機制的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2012,28(5):551-553,556.

[2] 李 妍，王月華，金 宏，等.膜型凋亡誘導配體脫落可能參與肺腺癌對 TRAIL 耐受[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2013,34(1)：39-43.

[3] 張金梅,吳 杰,常 城,等.去甲斑蝥素對肝癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志,2011,18(1):33-37.

[4] Geserick P,Drewniok C,Hupe M,et al.Suppression of cFLIP is sufficient to sensitize human melanoma cells to TRAIL- and CD95L-mediated apoptosis[J].Oncogene,2008,27(22):3211-3220.

[5] Li Ying,Sun Yan,Liu Fuyou,et al.Norcantharidin inhibits renal interstitial fibrosis by blocking the tubular epithelial-mesenchymal transition[J].PLoS One,2013,8(6):e66356.

[6] Gopalan A,Yu Weiping,Sanders B G,et al.Simvastatin inhibition of mevalonate pathway induces apoptosis in human breast cancer cells via activation of JNK/CHOP/DR5 signaling pathway[J].Cancer Lett,2013,329(1):9-16.

The effect of NCTD and IFN-γ on mTRAIL expression in Jurkat cells

LI Song-yan1，2,ZHANG Chen-hao1,LI Wen-ping1,LI Yan1*

(1.School of Medical Laboratory,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013；2.Jilin Judicial and Police Official College,Changchun,Jilin Province,130216，China)

Objective To study the effect of NCTD and IFN-γ on mTRAIL expression in Jurkat cells. Methods Jurkat cell was cultured in the medium of the different concentration of NCTD and IFN-γ.The TRAIL expression on the cell surface and the active oxygen levels in the cell were analyzed by flow cytometry. Results TRAIL’s expression of Jurkat were increased in a concentration dependent manner by IFN-γ and the effect of IFN-γ on TRAIL could be enhanced by NCTD;The active oxygen expression in the cells could be enhanced by NCTD. Conclusion TRAIL cells expression can be enhanced by NCTD in the way of signal pathway in regulating active oxygen.

TRAIL;NCTD;active oxygen

1673-2995(2014)01-0010-02

國家自然科學基金項目(82102953)；吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領軍人才及團隊項目(20130521018JH)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(2011420).

李松巖(1973-)，男(漢族)，講師,碩士.

李 妍(1972-)，女(漢族)，教授，博士.

R392

A

2013-11-04)