那文婷，韓景春，吳亞猛 ，李博雅，陳飛兒，趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院， 2.心理教研室，吉林 吉林 132013)

·論 著·

胡桃醌聯(lián)合順鉑對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

那文婷1，韓景春1，吳亞猛1，李博雅1，陳飛兒1，趙行宇2*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院， 2.心理教研室，吉林 吉林 132013)

目的 探討胡桃醌與順鉑(DDP)聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響。方法 采用不同濃度的胡桃醌或(和)順鉑處理肝癌HepG2細(xì)胞24 h,采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，通過MTT法檢測其對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果 不同濃度的藥物作用可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，MTT比色法測定顯示，采用胡桃醌、順鉑合用，可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，單用不同濃度的胡桃醌與順鉑分別作用于肝癌HepG2細(xì)胞后可以抑制其增殖且呈劑量依賴性。胡桃醌聯(lián)合順鉑增強(qiáng)了HepG2細(xì)胞的凋亡。結(jié)論 胡桃醌聯(lián)合順鉑與單藥相比能更顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，兩藥對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)具有一定的協(xié)同作用。

胡桃醌;增殖;順鉑

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，聯(lián)合化療在肝癌治療中越來越受到重視。順鉑是目前臨床上應(yīng)用較廣的一種高效抗癌藥物，但因其有肝、腎、神經(jīng)等毒性而使其應(yīng)用受到限制。胡桃醌(Juglone)是從新鮮的胡桃楸根皮、青果皮和枝皮中分離出來的醌類化合物，是胡桃楸中的主要毒性物質(zhì)[1],它具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，在體外對多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制效果[2-3]，并誘導(dǎo)其凋亡。現(xiàn)如今胡桃醌抗腫瘤的作用機(jī)制已不斷被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究揭示，聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為抗腫瘤研究的一個(gè)重要手段，它能夠成為克服單一治療障礙的有效手段[4]。胡桃醌和順鉑單獨(dú)用藥對肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用已經(jīng)得到證實(shí)[5-6]，因而本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合應(yīng)用胡桃醌和順鉑以及單獨(dú)應(yīng)用胡桃醌和順鉑作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，探討聯(lián)合用藥對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制，為其應(yīng)用于腫瘤的治療，減少順鉑的毒副作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞由吉林大學(xué)藥理教研室贈予；胡桃醌購自Sigma公司；DDP購自山東齊魯藥業(yè)公司；酶標(biāo)儀為BIO-BAD公司的MODEL 550型；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī) (上海醫(yī)用分析儀廠)；H110D電子分析天平(美國Sartorius)。倒置顯微鏡(上海醫(yī)用分析儀廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況并拍照,適量時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 MTT比色法測定抑制率

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液密度為5×104個(gè)/mL,按100 μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板。并用順鉑與完全培養(yǎng)液配制成20、30、40、50 μg/mL不同的濃度，用胡桃醌與完全培養(yǎng)液配制成40、80、120、160、200 μmol/L的不同濃度，設(shè)置不加藥的對照組和不加MTT的空白對照組，復(fù)孔數(shù)為3。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT 37 ℃孵育4 h，棄去上清后每孔加150 μL二甲基亞砜，在搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長測得吸光度值并記錄結(jié)果，利用公式計(jì)算抑制率：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)]×100%[7]。分別設(shè)置空白對照組、順鉑20 μg/mL組、胡桃醌40 μg/L組、聯(lián)合組(順鉑20 μg/mL+胡桃醌 μg/L)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后重復(fù)上述操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

對全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 處理后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

胡桃醌與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對肝癌HepG2細(xì)胞生長的抑制作用的形態(tài)觀察見圖1。倒置顯微鏡下可見對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，單用順鉑、胡桃醌后在顯微鏡下觀察細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍細(xì)胞脫離，生長狀態(tài)極差。聯(lián)合應(yīng)用順鉑與胡桃醌之后生長狀態(tài)更差，相比單用藥組現(xiàn)象更顯著。

2.2 MTT結(jié)果比對

不同濃度順鉑處理HepG2細(xì)胞24 h后采用MTT法測得各組吸光度，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞的抑制率對順鉑的濃度呈明顯劑量相關(guān)性，順鉑的濃度分別為20 μg/mL,30 μg/mL,40 μg/mL,50 μg/mL。以空白組做對照，測得各組OD值(見圖2)。從圖中可看出不同濃度順鉑對肝癌HepG2細(xì)胞的生長均有抑制作用，各組與對照組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。

不同濃度胡桃醌處理HepG2細(xì)胞24 h后采用MTT法測得各組吸光度，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞的抑制率對胡桃醌的濃度呈明顯劑量相關(guān)性，胡桃醌的濃度分別為40 μmol/L、80 μmol/L、120 μmol/L、160 μmol/L和200 μmol/L。以空白組做對照，測得各組OD值(見圖3)。從圖中可看出不同濃度胡桃醌對肝癌HepG2細(xì)胞的生長均有抑制作用，各組與對照組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。

40 μmol/L胡桃醌、20 μg/mL順鉑聯(lián)合處理細(xì)胞24 h之后，采用MTT法測得各組吸光度，從圖4中可看出，聯(lián)合用藥相比單藥使用可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖。各組與對照組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。

A.對照組;B.Juglone組;C.DDP組;D.聯(lián)合組

圖 2 不同濃度順鉑對HepG2細(xì)胞增殖的影響

(和對照組相比:*P<0.05,**P<0.01)

圖 3 不同濃度胡桃醌對HepG2細(xì)胞增殖的影響

(和對照組相比:*P<0.05,**P<0.01)

圖 4 聯(lián)合作用對HepG2細(xì)胞增殖的影響

(和對照組相比:*P<0.05,**P<0.01)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)將低劑量的胡桃醌和順鉑聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，觀察到相對于單獨(dú)使用胡桃醌和順鉑，細(xì)胞的生長狀態(tài)更差，存活的細(xì)胞數(shù)目減少，MTT結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥具有更明顯的抑制作用，提示胡桃醌聯(lián)合順鉑作用于HepG2細(xì)胞，起到抑制細(xì)胞增殖的作用。具體原因在本實(shí)驗(yàn)中并未探明，但李玲[8]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Juglone聯(lián)合順鉑能明顯抑制食管癌EC1細(xì)胞的增殖，并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M+S期，這也為本實(shí)驗(yàn)提供了一定的佐證，并指明了下一步方向。因此在Juglone聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的過程中，凋亡相關(guān)基因的變化及凋亡信號的產(chǎn)生還有待深入研究，以進(jìn)一步闡述胡桃醌和順鉑聯(lián)用在HepG2細(xì)胞殺傷中協(xié)同作用的作用機(jī)理。

[1] 萬志強(qiáng)，李 薇，崔 久，等.胡桃醌對白血病細(xì)胞增殖的抑制作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，38(3):486-489.

[2] 歐陽瑾,曹志友,王 爽,等.核桃青皮提取物抑制小鼠Lewis肺癌生長的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2009,11(2):232-233.

[3] 陳 麗,那順巴雅爾,張 建,等.胡桃醌對人肝癌BEL-7402細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(6):1208-1211.

[4] 李 清,金英花.抗腫瘤藥物聯(lián)合作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].中國生物制品學(xué)雜志，2011，24(9)：1112-1115.

[5] 趙行宇，楊 森，周麗霞,等.胡桃醌對肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,39(2):255-258.

[6] 周麗霞，楊 森，那文婷,等.順鉑對肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33(5)：278-280.

[7] 趙嘉惠，張華屏，王春芳.MTT法在檢測細(xì)胞增殖方面的探討[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(3)：262-263.

[8] 李 玲，陳 平，連鴻凱,等.Juglone聯(lián)合順鉑抑制食管癌細(xì)胞EC1細(xì)胞增殖的研究[J].山東醫(yī)藥，2010,50(17):72-73.

Effect of juglone combined with cisplatin on the proliferation of liver cancer HepG2 cells

NA Wen-ting1，HAN Jing-chun1，WU Ya-meng1，LI Bo-ya1，CHEN Fei-er1，ZHAO Xing-yu2*

(1.Clinical Medical College,2.Department of Psychology,Jilin Medical College,Jilin City，Jilin Province,132013，China)

Objective To explore the effect of Juglone combined with DDP on the proliferation of HepG2 cells. Methods Different doses of Juglone (DDP) were used to treat HepG2 cells,and optical microscope was used to observe the morphological changes of HepG2 cells,the proliferation inhibition of drugs on HepG2 cells was measured by MTT assay. Results Different doses of drugs lead to the morphological changes of HepG2 cells.MTT assay indicate that Juglone combined with DDP could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells in a dose dependent manner.Juglone combined with DDP could enhance the apoptosis of HepG2 cells. Conclusion Juglone combined with DDP could obviously inhibit the proliferation of HepG2 cells compared with different doses of Juglone or DDP alone,and enhance the apoptosis of HepG2 cells,Juglone and DDP have the synergistic effect on the HepG2 cells apoptosis.

Juglone;proliferation;DDP

1673-2995(2014)01-0023-03

吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生科研基金項(xiàng)目(2012-01).

那文婷(1990-)，女(漢族)，在讀本科.

趙行宇(1970-)，男(漢族),副教授,碩士.

R735.7

A

2013-11-03)