郭海濤，楊光勇，何光志

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002）

過敏性哮喘（Allergic Asthma）是臨床上最常見的支氣管哮喘類型，所占比例高達(dá)70%，兒童和青少年更可高達(dá)80%，其發(fā)病機制主要與IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，而任何類型的哮喘患者其血清IgE水平均增高[1]。為了探討間接ELISA法在檢測過敏性哮喘模型血清IgE中的應(yīng)用價值。本文通過制備過敏性哮喘模型，建立間接ELISA方法檢測實驗動物血清中的IgE的含量，用來觀察IgE含量的變化。本研究擬在哮喘病的臨床檢測中提供實驗依據(jù)。

1 試劑與材料

1.1 材料 普通SD大鼠（批號：SCXK(渝)2012-0005），購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司；超聲霧化器，購自深圳美久陽公司（型號：MY-520A）。

1.2 試 劑 Rat IgE ELISA Kit（ 批 號：20140224SE），由上海鑫樂生物科技有限公司提供；滅活的百日咳桿菌原液，由北京天壇生物制品股份有限公司提供；卵清蛋白（OVA，美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：326A057），北京索萊寶生物科技有限公司提供；氫氧化鋁（Al(OH)3）（批號：980819），購自貴陽東新化工有限公司。雷諾考特（布地奈德鼻噴霧劑產(chǎn)品，批號：國藥準(zhǔn)字J20090079）。

2 方法

2.1 過敏性哮喘模型的建立及干預(yù)實驗 把SD大鼠45只（其中雄性23只，雌性22只）隨機分為三組：哮喘組（15只）、空白對照組（15只）和西藥治療組（15只）。

致敏階段：哮喘組和西藥治療組分別在腹部皮下三處注射10%的OVA混合液1ml(含OVA 100mg、Al(OH)3 100mg及滅活的百日咳桿菌5×109個)進(jìn)行致敏，空白對照組也在腹部皮下三處注射生理鹽水1ml。1周后再進(jìn)行致敏。

激發(fā)階段：第2次致敏1周后進(jìn)行激發(fā)。把哮喘組和西藥治療組的大鼠放入自制的不完全封閉的箱中，接超聲霧化器放氣管；每次放入5只大鼠，5%OVA生理鹽水30min（約10mL），連續(xù)10d進(jìn)行激發(fā)；空白對照組用生理鹽水替代OVA進(jìn)行霧化吸入。每次霧化激發(fā)前30min，對西藥治療組的大鼠，腹腔注射治療劑量的布地奈德稀釋液[2]，對空白對照組注射同等體積的生理鹽水。

2.2 標(biāo)本采集 SD大鼠過敏性哮喘模型的建立，采用OVA進(jìn)行霧化的造模方法[3]。根據(jù)癥狀、組織病理學(xué)等[4]來證實造模是否成功，造模后分別用10%的水合氯醛溶液對哮喘組、空白對照組和西藥治療組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后處死，股動脈取全血，采用4500r/min離心5min，取上清液無菌分裝，置于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 將試劑盒中的SD大鼠IgE標(biāo)準(zhǔn)品（24U/ml）用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32 倍比作梯度稀釋。將SD大鼠陰性血清按照同樣的梯度用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液分別進(jìn)行稀釋。將兩組稀釋液分別加入酶標(biāo)板中（標(biāo)準(zhǔn)品每孔加50μL，陰性血清每孔加40μL），陰性血清每孔加入抗-IgE抗體10μL/孔，23℃孵育2h,用ELISA試劑盒中的洗液洗滌后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素50μL/孔，23℃反應(yīng)45min，經(jīng)洗滌后分別加入顯色劑A和B各50μL/孔，避光，23℃反應(yīng)30min。最后加入終止液50μL/孔，終止反應(yīng)，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD值。選擇陽性血清與陰性血清在濃度梯度范圍內(nèi)的OD450的比值（P/N）最大所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 ELISA方法的建立 用350μL/孔洗液洗酶標(biāo)板兩次，再加入350μL/孔洗液靜置浸泡15min，棄洗液，用吸水紙拍干，在濕潤狀態(tài)下立即使用酶標(biāo)板；將待檢測的血清按照最佳稀釋倍數(shù)加入酶標(biāo)板，40μL/孔；加入ELISA試劑盒中的抗-IGE抗體10μL/孔；封板膜封板，在恒溫振蕩器中，100轉(zhuǎn)/min，23℃孵育2h；棄掉液體，加入350μL/孔洗液，23℃靜置15s，棄洗液，再加入300μL/孔洗液，在恒溫振蕩器中，23℃，100轉(zhuǎn)/min，振蕩3min，棄洗液，此為一個洗板循環(huán)，如此循環(huán)洗板3次，用吸水紙拍干；加入最佳工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素50μL/孔，封板膜封板，在恒溫振蕩器中，100轉(zhuǎn)/min，23℃孵育45min；再次使用洗板循環(huán)3次洗板，用吸水紙拍干；加入分別加入顯色劑A和B各50μL/孔，避光，23℃恒溫箱孵育30min；最后加入終止液，50μL/孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行OD450和OD630雙波長測定。

2.5 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 酶標(biāo)二抗按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32作倍比稀釋，通過檢測已知陽性和陰性血清樣本，進(jìn)而確定酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度。

2.6 ELISA陰陽臨界值的確定 取5份同批次正常SD大鼠血清進(jìn)行ELISA檢測。同時設(shè)陽性和陰性對照。計算出本批次SD的大鼠OD450的()和標(biāo)準(zhǔn)差（s），按+3s公式計算陰陽臨界值。

2.7 特異性實驗 用本次試驗建立的ELISA方法分別檢測含有IFN-γ、IL-4的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清各5份，同時設(shè)IgE標(biāo)準(zhǔn)品5份為對照，鑒定該方法的特異性。

2.8 間接ELISA檢測IgE的應(yīng)用 用本次實驗建立的間接ELISA方法檢測空白對照組、哮喘組和西藥治療組實驗動物血清中的IgE的含量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 各組大鼠血清中IgE測定值采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所測數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗和單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 過敏性哮喘模型的觀察 外觀觀察：與其他組相比，哮喘組出現(xiàn)呼吸加深加快，點頭呼吸、張口呼吸、毛色黯淡無光、反應(yīng)遲鈍、出現(xiàn)抓臉現(xiàn)象，聽診有哮鳴音。

病理觀察：HE染色可見對照組肺泡大小正常，肺泡隔未見增寬，未見炎細(xì)胞浸潤（圖1）；哮喘組肺泡隔纖維組織增生，部分肺泡萎縮，間質(zhì)內(nèi)見慢性炎細(xì)胞浸潤（淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞）（圖2）；西藥治療組肺泡大小不等，肺泡隔增寬，間質(zhì)纖維組織增生，并見炎細(xì)胞浸潤（淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞，未見嗜酸性粒細(xì)胞，炎細(xì)胞分布以血管周較多，炎細(xì)胞數(shù)量較模型組稍減少）（圖3）。根據(jù)外觀的表現(xiàn)和病理學(xué)觀察，證明造模成功。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度及血清最佳稀釋倍數(shù)的測定 用ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和已知SD大鼠陰性血清進(jìn)行測定（3次重復(fù)），測得OD450。由表可知SD大鼠血清最佳稀釋倍數(shù)為1:1（表1）。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品梯度和血清最佳稀釋倍數(shù)確定（OD450 值）

圖1 對照組HE 染色（200×）

圖2 哮喘組HE 染色（200×）

圖3 西藥治療組（200×）

表2 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定（OD450 值）

表3 臨界值確定（OD450 值）

表4 ELISA 檢測IgE（OD450 值，n=10）

3.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的測定 選取陽性對照OD450大于1.0，陰性對照0.261，陰、陽性對照差異最大作為酶標(biāo)二抗的稀釋度即為最佳工作濃度，結(jié)果可見酶標(biāo)二抗1:4的稀釋濃度為最佳工作濃度（表2）。

3.4 臨界值確定 取5份相同批次的陰性SD大鼠血清采用ELISA檢測，每個樣品重復(fù)檢測1次，測得OD450以+3s公式計算，以（0.7075+3×0.014849）為臨界值，計算出臨界值為0.752（表3）。

3.5 特異性實驗結(jié)果 用本次實驗建立的ELISA方法分別檢測含有IFN-γ、IL-4的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清各5份，同時設(shè)IgE標(biāo)準(zhǔn)品5份為對照，結(jié)果顯示含有IgE標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450大于0.752，另外兩個標(biāo)準(zhǔn)品OD450均小于0.752。說明本次試驗建立的ELISA方法具有較強的特異性。

3.6 間接ELISA檢測IgE的應(yīng)用 用本實驗建立的ELISA法檢測空白對照組、哮喘組和西藥治療組IgE含量，經(jīng)SPSS分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)哮喘組血清中的IgE的OD450值（0.944±0.083）比空白對照組（0.687±0.039）明顯升高（P<0.05），西藥治療組（0.859±0.014）比哮喘組血清中的IgE含量降低（P<0.05）（表4）。

4 討論

過敏性哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等共同參與的慢性過敏性氣道炎癥性疾病，氣道平滑肌痙攣和氣道高反應(yīng)性為本病的兩大特征[5]，其具體發(fā)病機制目前尚不完全清楚。研究表明過敏性哮喘關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞是Th細(xì)胞[6]，Th主要包括兩種細(xì)胞Th 1和Th 2，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ 等細(xì)胞因子，而IFN-γ 可以對抗Th2細(xì)胞的功能[7]，抑制IgE的合成；Th2主要分泌IL-3、IL-4、IL-5和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等，并能促進(jìn)IgE的合成。在過敏性哮喘急性發(fā)作期，出現(xiàn)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用失常，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，Th1細(xì)胞功能低下，Th1/Th2比值低于正常，使得IgE被大量產(chǎn)生[8]，進(jìn)而使肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)，釋放白三烯、組胺、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子和血小板活化因子等，這些因子引起支氣管平滑肌痙攣、粘膜水腫、分泌增多等，使得支氣管腔狹窄，氣流受限，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展[9-10]。通過檢測患者血清中IgE的含量，可以對過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展及治療情況進(jìn)行早期診斷。

ELISA方法是一種免疫學(xué)技術(shù)，因其原理是抗原抗體特異性結(jié)合，具有較高的特異性，而且方法簡單、時間短，易于操作，適合在實驗條件差的基層采用[11]。本實驗通過ELISA方法檢測了空白對照組、哮喘組和西藥治療組大鼠血清IgE的OD450，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，哮喘組和西藥治療組大鼠血清IgE的OD450都有所增高，尤其哮喘模型組增高最明顯（P<0.05），提示哮喘組IgE的含量在質(zhì)上有所改變；而西藥治療組IgE低于哮喘組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），但高于空白對照組IgE水平（P<0.05）。研究結(jié)果表明ELISA方法適用于哮喘病的臨床檢測IgE含量。

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