康 嵐，姚 霞，朱健勛，姜大成*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，長春 130117；2.中國藥材公司，北京 102600)

林蛙皮為中國林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)剝?nèi)」∮蚚1]后廢棄的部分，主要為中國林蛙的皮膚。林蛙皮產(chǎn)量大、價格低廉，具有良好的潛在利用價值，對研究中國林蛙資源的再利用有重大意義。已有研究顯示，林蛙皮中含有豐富的生物活性物質(zhì),研究較多的有多糖[2-3]、抗菌肽[4]、蛙皮素及透明質(zhì)酸等。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，是人體皮膚真皮層的主要組成部分,具有改善皮膚水分狀況[5]，減少皺紋生成的作用[6]。

常用的膠原蛋白含量多采用成本較低、操作簡單的分光光度法進(jìn)行測定。利用測定膠原蛋白水解后會產(chǎn)生的特異的氨基酸L-羥脯氨酸的含量，用以明確膠原蛋白的總體水平,如Worssner比色法[7]。本研究利用Worssner比色法測定了吉林省樺甸市產(chǎn)林蛙皮中L-羥脯氨酸的含量，對林蛙皮中膠原蛋白含量進(jìn)行了研究，為充分利用林蛙皮中膠原蛋白資源，增加中國林蛙經(jīng)濟效益，并為深入研究林蛙皮中膠原蛋白打下了基礎(chǔ)。

1 儀器和試劑

TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，RM-220型超純水機(四川沃爾特科技發(fā)展有限公司)，pHS-25數(shù)顯酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司),FA1004B型電子天平(上海佑科有限公司)。

L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111578-200201)。檸檬酸、對二甲氨基苯甲醛、高氯酸溶液、冰醋酸、氯胺T、Na2CO3為分析純。

中國林蛙采集于吉林省樺甸市蘇密溝林場，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教師鑒定為中國林蛙(RanatemporariachensinensisDavid)。樣品剝?nèi)×滞芷?，干燥后備用?/p>

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品液制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取L-羥脯氨酸11.9 mg溶于少量蒸餾水中，加入一滴6 mol/L濃鹽酸，溶解后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，即得L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度為467 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取蛙皮約2 g，用清水浸泡至舒展、變軟，然后浸泡于50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液中30 min，清水洗去堿液，重復(fù)浸泡1次,用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，置于錐形瓶中，加入6 mol/L的濃鹽酸50 mL,置于100 ℃水浴鍋中水浴8 h，過濾，濾液揮干鹽酸，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，作為供試品溶液。

2.2 測定波長選擇 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和樣品溶液2 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)整pH=6，用蒸餾水定容至100 mL，吸取定容后的溶液1 mL于比色皿中，利用Worssner比色法在400～600 nm波長范圍內(nèi)測定吸收光譜。L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液在558 nm處有最大吸收峰，樣品溶液在561 nm處有最大吸收，故選擇560 nm為測定波長。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.5、1、1.5、2、2.5,用蒸餾水分別定容到100 mL。以蒸餾水為空白溶劑，在560 nm下測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=71.276X+0.064，r=0.999 7(n=5)。結(jié)果表明，樣品液在2.38～11.90 μg/mL呈線性關(guān)系。

2.4 精密度考察 取同一供試品溶液2 mL，于560 nm下重復(fù)測定5次，其吸光度的RSD=0.96%，表明儀器的精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液2 mL，利用Worssner比色法分別在顯色后0，5，10，15，20 min時測定吸光度，其RSD=2.13 %，表明供試品溶液在顯色后20 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性考察 精密稱取同一樣品5分，按2.1.2制備成供試品溶液，于560 nm下測定吸光度，計算含量，其RSD=0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的同一樣品6分，每分0.1 g,精密稱定，分別精密加入適量，按2.1.2制備供試品溶液，按上述方法測定吸光度，計算加樣回收率,結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測定 按照2.1.2 項下制備供試品溶液，并按照建立的方法測定林蛙皮藥材中L-羥脯氨酸的含量，測定結(jié)果為吉林省樺甸市蘇密溝林場采集林蛙皮樣品中L-羥脯氨酸的含量為37.7 mg/g。

表1 L-羥脯氨酸加樣回收率試驗

3 小結(jié)

在供試品溶液制備工程中，分別考察不同提取方法、提取溶解、提取時間以及樣品溶液比率對L-羥脯氨酸含量的影響，結(jié)果顯示提取溶劑為樣品量25倍，浸泡時間30 min,水浴時間8 h時可達(dá)到最大提取率。樣品測定結(jié)果顯示利用Worssner比色法測定林蛙皮中L-羥脯氨酸方法高效、穩(wěn)定、可靠，可用于評價林蛙皮中膠原蛋白的含量。

本方法以林蛙皮中L-羥脯氨酸含量為主要研究內(nèi)容,采用可見分光光度法進(jìn)行測定。同時對林蛙皮中膠原蛋白含量進(jìn)行了評價，為后期開展相關(guān)工作提供了數(shù)據(jù)支持。本方法也可應(yīng)用于今后林蛙皮質(zhì)量控制研究中，為合理開發(fā)利用這一資源提供了基礎(chǔ)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]王大為,張艷榮,沙坤.中國林蛙皮多糖類天然保濕因子的提取與鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,24(6):99-102.

[3]趙玉紅,趙小旭,姜曉青.超聲波-雙酶法協(xié)同提取林蛙皮多糖的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(11):230-234.

[4]周涌,張嵐,李杰,等.木瓜蛋白酶水解林蛙皮制備活性肽的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(15):8564-8566.

[5]蔣挺大.蛋白與膠原蛋白[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:28.

[6]李賀,鄭庚修,王秋芬,等.生物醫(yī)學(xué)材料膠原蛋白的研究進(jìn)展(I)[J].中國皮革,2005,34(11):24-27.