張超凡，王新軍,2，劉俊昌,2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院 新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830001)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是臨床上常見的慢性中老年疾病,其以膝關(guān)節(jié)的僵硬、疼痛、腫脹和功能障礙為主要表現(xiàn)，后期嚴(yán)重者可明顯影響生存質(zhì)量并致殘[1]。目前，KOA已受到“國際骨與關(guān)節(jié)十年”組織，聯(lián)合國以及各發(fā)達(dá)和發(fā)展中國家政府的普遍重視。我國國內(nèi)六大城市KOA的總患病率為15.6%[2];北京市城區(qū)60歲以上人群中，有KOA影像學(xué)表現(xiàn)的男女性患病率分別為21.5%和42.8%，其中女性的臨床患病率比Farminghan研究中的女性高出了40%[3]。隨著人口老齡化的進(jìn)程,KOA的患病人數(shù)正在不斷上升，隨之給患者帶來的治療壓力和經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)也越來越大。相對(duì)于關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、關(guān)節(jié)置換等西醫(yī)療法，推拿、針灸、中藥外治等中醫(yī)外治療法具有經(jīng)濟(jì)、安全、見效快等特點(diǎn)。目前的外用中藥多為單味藥及提取物的制劑，而復(fù)方制劑相對(duì)稀少；而且，膏摩作為外用中藥與推拿相得益彰的結(jié)合，也曾一度被忽視，再而能夠通過合理的試驗(yàn)對(duì)其療效機(jī)理進(jìn)行驗(yàn)證和解釋的研究更是寥寥無幾。陳元膏摩方是由蒼梧道士的古方化裁而來，方含：川芎、秋水仙、黑附片等多種藥物,是臨床治療KOA有效的組方[4]。本研究希望可以通過觀察陳元膏摩對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中Ⅰ、Ⅱ型膠原的影響，來探討其對(duì)關(guān)節(jié)軟骨是否有保護(hù)作用，從而為此療法臨床治療KOA提供切實(shí)的科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康清潔的成年SD雌性大鼠52只，體質(zhì)量為300～350 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物 陳元膏摩方(方含川芎、秋水仙、黑附片等藥物，以當(dāng)歸為君藥，凡士林、羊毛脂為基質(zhì),根據(jù)油脂軟膏的制作工藝，委托新疆醫(yī)科大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室一次性制作完成)、凡士林(由新疆醫(yī)科大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3 主要試劑 Ⅰ型膠原山羊多克隆抗體，Ⅱ型膠原兔多克隆抗體(美國santa cruz公司)，SP-9000免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.4 主要儀器和耗材 樹脂石膏繃帶，珠海麗珠生物材料有限公司;光學(xué)顯微鏡,日本尼康公司E200；病理圖文分析軟件，湖南千屏有限公司；圖片分析軟件。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模 52只健康清潔的雌性SD大鼠，購買后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為4組：正常組(A組)、模型組(B組)、陳元膏試驗(yàn)組(C組)和手法對(duì)照組(D組)各13只。采用石膏屈曲位固定法對(duì)B、C、D組的大鼠進(jìn)行KOA的造模。方法如下：管型石膏屈曲位固定大鼠左下肢膝關(guān)節(jié)，范圍從踝關(guān)節(jié)直至腹股溝處，并以鐵絲和繃帶外固定。每日檢查石膏的固定情況，若有石膏脫落、咬損或下肢腫脹等情況立即重新固定。

2.2 干預(yù)方法 8周后統(tǒng)一拆除石膏，正常組(A組)和模型組(B組)不作處理;陳元膏試驗(yàn)組(C組)和手法對(duì)照組(D組)定期剔除大鼠左下肢膝關(guān)節(jié)周圍的毛發(fā)，在以髕韌帶為中心約4 cm2的范圍內(nèi)，分別均勻涂以陳元膏劑和凡士林2 g/只，并均結(jié)合手法治療，每天1次，持續(xù)8周。手法由同一名接受過專業(yè)推拿培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行操作，具體手法如下:1)治療者分別用拇指和食指按揉膝關(guān)節(jié)周圍軟組織及大腿、小腿周圍肌肉，力量以局部皮膚發(fā)熱或藥物顏色吸收變淺為度，重復(fù)60次。2)治療者手握大鼠足掌，帶動(dòng)大鼠膝關(guān)節(jié)做屈伸運(yùn)動(dòng)，屈伸程度以大鼠無嘶叫或撕咬掙扎為度，重復(fù)20次。手法操作完畢后，為防止大鼠舔食殘留藥物而妨礙吸收，將其在制動(dòng)瓶中制動(dòng)1 h，再擦盡藥漬放回籠中。

2.3 取材與標(biāo)本處理 干預(yù)滿8周后，麻醉4組大鼠，切取左膝整個(gè)股骨髁,4%多聚甲醛固定48 h，進(jìn)行脫鈣及石蠟包埋、切片。

2.4 觀察指標(biāo) 切片后,HE染色并在光鏡下對(duì)其組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)的觀察。每張切片選擇3個(gè)不同的視野，并參照Mankin關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行積分統(tǒng)計(jì)。切片進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ型膠原的免疫組化染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并照片，計(jì)算陽性染色積分光密度(采用IPP6.0軟件進(jìn)行測(cè)定)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，再進(jìn)行組間兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HE染色觀察 正常組關(guān)節(jié)軟骨HE染色其軟骨細(xì)胞形態(tài)完整，分布均勻且排列整齊；模型組軟骨層明顯變薄，結(jié)構(gòu)不規(guī)則且多有裂隙，其中，深層軟骨細(xì)胞開始萎縮變小且數(shù)目明顯減少；陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組均可見軟骨表層不平整，中層細(xì)胞排列不齊且包含較多的同源軟骨細(xì)胞。見圖1。

3.2 軟骨中Ⅱ型膠原的表達(dá) 正常組關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色呈棕黃色網(wǎng)狀纖維，均勻分布于軟骨全層；模型組軟骨全層著色明顯減弱，Ⅱ型膠原僅在軟骨深層的個(gè)別同源軟骨細(xì)胞及其周圍基質(zhì)中有輕微表達(dá)；陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組Ⅱ型膠原主要表達(dá)在軟骨中、深層的多數(shù)軟骨細(xì)胞、同源軟骨細(xì)胞及基質(zhì)中，其中陳元膏試驗(yàn)組相對(duì)于手法對(duì)照組染色較深，分布較多，但都沒有正常組明顯。見圖2。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色(×400)

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨免疫組化Ⅱ型膠原染色(×400)

3.3 軟骨中Ⅰ型膠原的表達(dá) Ⅰ型膠原免疫組化染色為棕黃色網(wǎng)狀或條絮狀纖維，且均分布于軟骨下骨中，而在軟骨層其染色均為陰性。4組中模型組軟骨下骨中有均勻的大面積棕色著色；手法對(duì)照組有部分的棕色著色，其陽性面積大約占到骨基質(zhì)的1/3;而陳元膏試驗(yàn)組僅有少部分骨基質(zhì)呈淡棕色，且著色面積較少，其余區(qū)域則完全呈陰性；正常組軟骨下骨中未見十分明顯的陽性著色。見圖3。

圖3 各組關(guān)節(jié)軟骨免疫組化Ⅱ型膠原染色(×100)

3.4 軟骨Mankin評(píng)分及Ⅰ、Ⅱ型膠原表達(dá)的比較 Mankin評(píng)分：模型組評(píng)分明顯高于正常組(P<0.01)；而陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組均明顯低于模型組(P<0.05)。Ⅱ型膠原的表達(dá)：模型組的表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)，而陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組均顯著高于模型組(P<0.01)；其中以陳元膏試驗(yàn)組的表達(dá)較高(P<0.05)。Ⅰ型膠原的表達(dá)：正常組、陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組均明顯低于模型組(P<0.05)，其中以陳元膏試驗(yàn)組和手法對(duì)照組的表達(dá)較高，具體見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分、Ⅱ型膠原及軟骨下骨Ⅰ型膠原的表達(dá)

4 討論

KOA以膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變?yōu)橹?，Ⅱ型膠原是軟骨組織最主要的成分,約占膠原總量的90%，可作為軟骨的表型標(biāo)記，是評(píng)價(jià)軟骨修復(fù)質(zhì)量的標(biāo)志之一[6]。Ⅰ型膠原由于含量不到膠原總量的1%，正常情況下也較少檢測(cè)到，所以一般認(rèn)為正常關(guān)節(jié)軟骨中不含Ⅰ型膠原[7]。骨性關(guān)節(jié)炎(OA)不但導(dǎo)致軟骨中Ⅱ型膠原明顯丟失,同時(shí)也引起軟骨細(xì)胞去分化合成Ⅰ型膠原[8]。

膏摩療法最早記載于先秦《五十二病方》[9],指用不同藥膏作為介質(zhì)，以增加療效的一種推拿方法。膏摩療法的最大特點(diǎn)在于其發(fā)揮了藥與摩的綜合作用。一方面手法可加快和促進(jìn)藥物的深入滲透，另一方面藥物也可協(xié)助手法達(dá)到活血化瘀、祛風(fēng)除濕等功效。中唐時(shí)期的《外臺(tái)秘要卷三十一，古今諸家膏四首》提到：“處地下濕，身病苦痹……思取藥摩之。日至再，十五日平復(fù)?！倍筮@張膏摩方被收錄于《千金翼方·卷十六·諸膏第三》中。

本研究的陳元膏摩方即由上述古方化裁而來，組方中除了川芎、當(dāng)歸、黑附片等活血化瘀、舒筋通絡(luò)的中藥材外，還加入了維藥秋水仙。維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，秋水仙屬性可清除異常黏液質(zhì)[10]，抽祛機(jī)體深層稠黏異常體液?，F(xiàn)代藥理研究表明：川芎的有效成分川芎嗪能通過降低OA軟骨中MMP-1的水平,增加TⅠMP-1的水平,起到保護(hù)和修復(fù)早期OA關(guān)節(jié)軟骨的作用[11]。但陳元膏摩是組方與手法結(jié)合的療法，其療效機(jī)理正有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)中,陳元膏試驗(yàn)組軟骨中Ⅱ型膠原含量及Mankins評(píng)分與模型組相比都有明顯差異(P<0.05)，提示陳元膏摩可通過增加關(guān)節(jié)軟骨中Ⅱ型膠原的表達(dá)，維持正常的軟骨膠原表型，起到保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。

有關(guān)OA關(guān)節(jié)軟骨中是否存在Ⅰ型膠原其實(shí)尚存爭(zhēng)議。Adam M等[12]應(yīng)用生化方法檢測(cè)出OA關(guān)節(jié)軟骨中含有Ⅰ型膠原，而同樣的方法Goldwasser M等[13]卻沒有測(cè)出。后來，人們用免疫組化方法測(cè)定人體OA標(biāo)本后，也得出相矛盾的結(jié)論[14-15]。近年來，郭秦?zé)榌16]、裴明[17]等國內(nèi)學(xué)者的研究顯示：在原發(fā)性O(shè)A時(shí)，Ⅰ型膠原的表達(dá)僅限于軟骨下骨，而軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原染色均為陰性。本研究的結(jié)果即與此結(jié)論相一致，模型組和治療組中，Ⅰ型膠原都僅在軟骨下骨中呈現(xiàn)陽性，而在簇聚軟骨細(xì)胞和和軟骨基質(zhì)中均呈現(xiàn)陰性，這也在一定程度上否定了Adam等提出的OA軟骨中Ⅰ型膠原是由簇聚軟骨細(xì)胞合成的結(jié)論。雖然Mayne等在體外培養(yǎng)的OA軟骨細(xì)胞能合成大量的Ⅰ型膠原，但是在體內(nèi)的原發(fā)性O(shè)A的軟骨細(xì)胞并不能合成Ⅰ型膠原。這種差異可能是因?yàn)榧?xì)胞的膠原合成過程會(huì)受到周圍環(huán)境的影響，而體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞所處的環(huán)境與體內(nèi)存在很大差異[16]。而利用生化的方法之所以能從OA軟骨中檢測(cè)測(cè)出少量的Ⅰ型膠原，可能是因?yàn)樵谌〔臅r(shí)軟骨中混入了少量軟骨下骨或者韌帶組織所造成的。

另外，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M中，有2個(gè)樣本Ⅱ型膠原的表達(dá)不降反增，筆者推測(cè)這可能是軟骨細(xì)胞的代償表現(xiàn)。Ⅱ型膠原在軟骨細(xì)胞被破壞到一定程度之前，其合成量仍大于分解量，而到OA晚期，軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重破壞時(shí)，其總量才會(huì)隨著合成量的減少而減少。本試驗(yàn)的結(jié)果中，軟骨下骨內(nèi)Ⅰ型膠原的表達(dá)與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這可能是由于軟骨下骨的自身修復(fù)所造成的。軟骨下骨組織在承受較高壓力的情況下會(huì)發(fā)生微骨折[18]，其在修復(fù)早期形成的纖維軟骨細(xì)胞是能夠合成Ⅰ型膠原的[19]。

OA關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的變化較為復(fù)雜，既可見到軟骨細(xì)胞的固縮、破裂、壞死，又伴有部分軟骨細(xì)胞的活躍、基質(zhì)內(nèi)膠原纖維的增加。目前，這些“軟骨—軟骨下骨單位”和“骨—軟骨連接處”的生物學(xué)研究已逐漸受到重視，相信在不久的將來一定可以得到徹底的研究，并為KOA的治療提供科學(xué)的依據(jù)。

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