黃怡然,李文迅,張 茜,李 娜,余 飛,金英利,雷林丹,李玉波,郭長青

(北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京100029)

骨關節(jié)炎(OA)是臨床常見致殘率較高的關節(jié)疾病，其特點是關節(jié)周圍軟組織損傷，從而導致關節(jié)軟骨損傷的發(fā)生，最終累及整個關節(jié)，形成關節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、潰瘍及整個關節(jié)面的損害。膝骨關節(jié)炎(KOA)以膝關節(jié)疼痛、僵硬和肌肉運動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)。研究結果認為,KOA是由于一系列作用而導致的關節(jié)異常性塑形重建產(chǎn)生的[1]，軟骨體內(nèi)平衡的維持與骨相似,當發(fā)生KOA時關節(jié)軟骨基質的喪失包括關節(jié)軟骨減壓區(qū)域的軟骨鈣化和增壓區(qū)的軟骨細胞壞死[2]。相關研究還認為，關節(jié)軟骨的纖維化和剝脫大于其塑形重建，僅在關節(jié)面不同部位的基底鈣化軟骨上才有纖維化和塑形重建同時存在。塑形重建主要發(fā)生在非負重區(qū)，而纖維化則在負重區(qū)特別明顯[3]。這一過程較為復雜，但已經(jīng)明確的是,關節(jié)軟骨的塑形重建是形成進行性KOA病理過程的重要原因。中醫(yī)骨傷科文獻提出“骨正筋柔”“筋骨并重”等概念，針刀、圓利針等松解法以“調(diào)筋治骨”為基本原則，通過對膝關節(jié)周圍軟組織的松解，降低軟骨基質退變及骨質硬化、增生等現(xiàn)象，即通過“調(diào)筋”改善和恢復了關節(jié)的“筋”“骨”平衡，達到了“治骨”的效果。因此，與電針對照，開展針刀、圓利針松解法對膝骨關節(jié)炎模型兔軟骨形態(tài)學的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

1 實驗材料

1.1 材料 健康新西蘭大白兔45只，體質量2.0～2.5 kg，由北京金牧陽實驗實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(京)2013-0022。實驗過程中對動物的處置嚴格遵守國家科技部2006年發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。動物自由飲水和攝食，光照與黑暗為12 h交替，室溫為20～22 ℃。按隨機原則將動物分為5組，正常對照組、模型組、針刀組、電針組、圓利針組，每組9只，其中每組1只用于造模成功的病理檢測，其余8只用于其他指標檢測。

1.2 主要試劑及儀器設備 試劑：4%多聚甲醛、100%乙醇、碘伏、蘇木素伊紅染色試劑、EDTA-2Na、石蠟、磷酸緩沖液、二甲苯等試劑均采購自北京百諾威生物科技有限公司；2.5%戊二醛、丙酮、醋酸鈾、枸櫞酸鉛、餓酸(美國SPI)、環(huán)氧樹脂618(E51)包埋劑、150目帶膜銅網(wǎng)等均購自北京中科科儀技術發(fā)展有限責任公司。儀器:石蠟切片機(Leitz 1410型，德國)，BMJ-Ⅲ型包埋機及冷凍臺(中國)，H8-202型尼康顯微鏡(日本Nikon)，奧林巴斯全自動顯微攝影系統(tǒng)(日本)，超薄切片機(瑞典LKB)，Quanta 250掃描電子顯微鏡(捷克FEI，北京中醫(yī)藥大學電鏡室)。

2 實驗方法

2.1 造模方法 改良后的Videman法左后肢伸直位固定制動法[4]：造模前動物禁食10～16 h，以3%戊巴比妥鈉溶液按30 mg/kg劑量耳緣靜脈注射麻醉，剪去左后肢踝關節(jié)以上兔毛，牽拉使其處于完全伸直位，速干型石膏繃帶經(jīng)65～85 ℃熱水浸泡軟化后，從腹股溝到趾頭固定(膝關節(jié)伸直180°，踝關節(jié)背屈60°),留出足趾觀察血供，石膏繃帶外用彈力醫(yī)用繃帶固定防止兔撕咬，共制動6周[5]。如足趾有壞死傾向，立刻拆除石膏繃帶,待腫脹消退后再重新固定。若石膏繃帶松動或脫落及時重新固定。造模滿6周(造模后6周)時從各組動物隨機抽取1只處死，取關節(jié)軟骨作病理觀察，可見病變關節(jié)軟骨淺表區(qū)粗糙或有炎性腫脹，產(chǎn)生裂隙，深達輻射區(qū)，深層細胞數(shù)目異常，表現(xiàn)為細胞數(shù)目減少或簇聚，造模成功后將所有動物石膏固定拆除。

2.2 干預處理與取材 1)干預處理?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)。模型組：造模后正常飼養(yǎng)。電針組：造模后6周起，電針KOA兔左側“正極：陽陵泉，負極：陰陵泉”和“正極：內(nèi)膝眼，負極：外膝眼”。取穴參照《實驗針灸學》并結合動物比較學方法，根據(jù)比較解剖取穴法結合模擬骨度取穴法，選取膝關節(jié)上述腧穴進行治療。以韓氏穴位神經(jīng)刺激儀行電針刺激治療，分別連接陽陵泉和陰陵泉，內(nèi)膝眼和外膝眼。波形疏密波，頻率2/100 Hz，強度3 mA，每次20 min。隔日治療1次，1周3次，共6周。針刀組：造模后6周起,兔膝關節(jié)左側針刀進針部位,以龍膽紫定位，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，出針并按壓片刻止血。每周1次，共6次。選用HZ系列一次性針刀，各進針點具體操作如下。①內(nèi)、外側副韌帶進針點操作:針刀于韌帶中點前緣進針，刀口線與韌帶方向平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，向韌帶起、止點方向分別松解5次，出刀并加壓片刻。②髕韌帶進針點操作:刀口線與髕韌帶縱軸平行，刀體和髕韌帶皮膚切面垂直，快速剌入達髕韌帶下,由上而下松解5次，出刀并加壓片刻。圓利針組：造模后6周起，常規(guī)備皮、消毒，進針點與針刀組相同，松解5次。一次性圓利針，每周1次，共6次。2)取材。所有干預結束1周后,采用空氣栓塞法處死動物，打開膝關節(jié)腔，肉眼觀察KOA兔膝關節(jié)周圍韌帶、滑膜、關節(jié)囊、關節(jié)液等一般表現(xiàn),并以彭太平法組織病理學分級標準分級[6],并迅速取矢狀位在股骨外側髁切取2 mm×3 mm×5 mm大小的帶有軟骨下骨質的軟骨標本2塊，一塊標本置于4%多聚甲醛溶液進行組織固定，用于HE染色光鏡觀察；另一塊標本置于2.5%的戊二醛進行組織固定,用于掃描電鏡檢測。3)數(shù)據(jù)處理和結果分析。采用光學顯微鏡下觀察實驗性KOA兔關節(jié)軟骨潮線及間隙、鈣化層及深層軟骨改變情況，并于掃描電鏡下觀察關節(jié)軟骨表面超微結構變化。使用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，并對各組之間進行比較，計數(shù)資料用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 彭太平法組織病理學分析結果 根據(jù)彭太平法組織病理學分級，大體觀察各組兔膝關節(jié)周圍韌帶、滑膜、關節(jié)囊、關節(jié)液的一般表現(xiàn)，結果見表1。

表1 各組兔彭太平關節(jié)軟骨分級法對各組兔膝關節(jié)評分

注：與正常組相比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.2 關節(jié)軟骨HE染色結果 見圖1～5。

圖1 正常組

圖1為正常組兔左側膝關節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見：關節(jié)軟骨厚度正常，軟骨表面光滑、連續(xù)，軟骨細胞形態(tài)正常，均勻呈柱狀排列，潮線清晰完整，無血管翳生成。

圖2 模型組

圖2為模型組KOA兔左側膝關節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關節(jié)軟骨層狀結構消失，軟骨表面細胞破損嚴重、出現(xiàn)大量剝脫缺損深達潮線，表層軟骨細胞稀少，細胞排列呈無序狀，層次紊亂，軟骨細胞巢居，潮線模糊、斷裂、甚至消失，部分軟骨有少量血管翳生成。

圖3 針刀組

圖3為針刀組KOA兔左側膝關節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關節(jié)軟骨厚度正常，軟骨表面較光滑、連續(xù)，軟骨細胞形態(tài)總體正常，均久呈柱狀排列，潮線較清晰完整，部分潮線模糊，有少量血管翳生成。

圖4 電針組

圖4為電針組KOA兔左側膝關節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關節(jié)軟骨厚度變薄，軟骨表面欠光滑、出現(xiàn)少量剝脫缺損，部分深達潮線，表層軟骨細胞較正常組增多，部分細胞排列呈無序狀，層次紊亂較嚴重，軟骨細胞巢居，部分潮線模糊、斷裂，有少量血管翳生成。

圖5 圓利針組

圖5為圓利針組KOA兔左側膝關節(jié)軟骨HE染色放大100倍。鏡下可見:關節(jié)軟骨厚度接近正常，軟骨表面較光滑、出現(xiàn)少量剝脫缺損，部分深達潮線，表層軟骨細胞較正常組減少，部分細胞排列呈無序狀，層次稍紊亂，軟骨細胞巢居，部分潮線模糊、斷裂，有少量血管翳生成。

3.3 關節(jié)軟骨掃描電鏡觀察結果 見圖6～10。

圖6 正常組

圖6為正常組兔膝關節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面光滑，有凝膠樣物質無定形物質均勻覆蓋，其下膠原纖維結合成束，呈波紋狀結構與溝紋相間并規(guī)則排列，具有典型的拱形結構，其壟部和溝部相互平行，波峰間距均等。

圖7 模型組

圖7為模型組KOA兔膝關節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面破損嚴重，表面結構改變最為明顯，裂隙增寬、加深，部分膠原纖維裸露，部分軟骨基質丟失，壟溝排列基本消失，有大量裂縫，表面凝膠樣物質大量剝脫并有巖石樣凝膠顆粒附著，大量膠原纖維暴露、斷裂撕脫呈網(wǎng)狀，部分翻起，并排列紊亂。

圖8 針刀組

圖8為針刀組KOA兔膝關節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面欠光滑，壟溝排列變淺，壟溝狀排列尚隱約可見，表面小凹陷，無定形物部分消失，代之以纖維素樣物質， 未見凝膠樣物質剝脫掀起，膠原纖維尚未暴露，并出現(xiàn)微孔。

圖9 電針組

圖9為電針組KOA兔膝關節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見:軟骨表面粗糙，裂隙增寬、加深，部分膠原纖維裸露，部分軟骨基質丟失，壟溝排列變淺，凝膠樣物質剝脫掀起，部分膠原纖維裸露、松散，甚至斷裂，粗細不均，并出現(xiàn)微孔。

圖10 圓利針組

圖10為圓利針組KOA兔膝關節(jié)軟骨掃描電鏡下放大5 000倍。鏡下可見：軟骨表面欠光滑，壟溝排列變淺，壟溝狀排列尚隱約可見，表面小凹陷，無定形物部分消失，代之以纖維素樣物質，少量凝膠樣物質剝脫掀起，有細小淺表裂縫，或呈皮疹樣改變，并出現(xiàn)微孔。

4 討論

針刀療法、電針療法、溫針灸療法、火針療法、三棱針療法等療法在中醫(yī)臨床治療膝骨性關節(jié)炎療效顯著，但機理研究尚為薄弱[7-8]。綜合本實驗關節(jié)軟骨形態(tài)學變化可得出，制動的造模措施造成KOA模型兔關節(jié)軟骨大體解剖以及超微結構的病理變化,印證了模型復制成功且穩(wěn)定。針刀、電針和圓利針3種干預治療措施能有效改善軟骨的損害，從彭太平關節(jié)軟骨評分、HE染色切片和掃描電鏡結果示針刀組治療效果優(yōu)于圓利針和電針組，電針組和圓利針組相比,圓利針組改善較佳。這與嵇波[9]、覃蔚嵐[10]等學者的研究結果一致，針刀松解術可減緩KOA軟骨的退變,可促進軟骨表面形成新生纖維組織和骨祖細胞的形成，有形成軟骨母細胞的趨勢。從形態(tài)學指標變化，可示針刀和圓利針以關節(jié)周圍阿是穴(主要是肌肉韌帶的起止點)為主要刺激部位的松解針刺法的總體效果優(yōu)于以腧穴特異性指導下的電針取穴治療，進一步印證了《靈樞·經(jīng)筋》提出的經(jīng)筋病“以痛為輸”的治療原則，也進一步說明了針刀、圓利針通過松解病變關節(jié)周圍的肌肉、肌腱及韌帶等軟組織(即筋肉)，即通過“調(diào)筋治骨”恢復關節(jié)周圍的“筋骨平衡”，達到治療效果的科學性。

膝骨關節(jié)炎不僅發(fā)生關節(jié)軟骨損傷，同時還累及整個關節(jié)，包括關節(jié)周圍肌肉、肌腱、韌帶、軟骨下骨、關節(jié)囊和滑膜，最終發(fā)生關節(jié)軟骨退變、纖維化、斷裂、潰瘍及整個關節(jié)面的損害。KOA關節(jié)的病理變化可看做關節(jié)周圍軟組織以及骨關節(jié)系統(tǒng)反應性結構損害與修復的過程，無論在病程發(fā)展還是干預治療的過程中，病變關節(jié)部位的退行性變與組織修復始終伴行。對此,國外近10年來進行了卓有成效的研究，并初步提出肌肉功能障礙學說與KOA發(fā)生發(fā)展的關系問題。由于KOA破壞的終端在軟骨和骨組織，因此許多研究集中于軟骨的損害與修復，對于膝關節(jié)周圍軟組織的關注較少，但軟骨乃至骨病變發(fā)生于過度的機械負荷是關節(jié)受到的原有應力平衡打破導致的最終結果。相關研究[11]認為,針刀療法可使KOA兔膝關節(jié)軟骨細胞破壞程度和膠原纖維的紊亂程度明顯減少，對動物中樞水平的β-內(nèi)啡呔及血清的炎性細胞因子有良性調(diào)節(jié)作用。目前實驗研究大多集中于軟骨損害卻忽視了KOA早期的肌肉、韌帶損傷等病理基礎，或者可以說，肌肉等軟組織的損傷是膝關節(jié)軟骨損傷的前提和原因，也就是說中醫(yī)學所說的“筋”即肌肉、韌帶等軟組織的損傷發(fā)生于KOA早期。

“膝為筋之府”,根據(jù)中醫(yī)骨傷科文獻提出的“筋骨并重”等相關理論，針刀松解法對KOA的治療以調(diào)筋治骨為基本原則。有學者認為膝關節(jié)炎與“筋傷”關系密切，急、慢性損傷性應力造成膝關節(jié)周圍軟組織(經(jīng)筋)損傷，引起勞損點黏連進而引發(fā)軟骨退變、關節(jié)囊肥厚、骨贅增生等病變。因“傷筋而損骨”，并形成二者之間的惡性循環(huán)，破壞了膝關節(jié)的力學平衡，也就是改變了經(jīng)筋“束骨而利機關”的作用，使膝關節(jié)出現(xiàn)力學平衡失調(diào)，從而使關節(jié)軟骨的形態(tài)功能發(fā)生退變，最終導致KOA的發(fā)生。因此，膝部經(jīng)筋的力學因素在KOA的發(fā)病中起著非常重要的作用，故以針刀松解法為代表的“調(diào)筋治骨”思路的作用機制值得探討。

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