唐 成, 陳 露, 安敏敏, 孟 丹, 楊立明, 羅玉明

(1.淮安市高新技術(shù)創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223301;2.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 淮安 223300;3.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210046)

水稻幼苗葉片應(yīng)答稻瘟病侵染的差異蛋白譜分析

唐 成1, 陳 露2,3, 安敏敏2, 孟 丹2, 楊立明2, 羅玉明2

(1.淮安市高新技術(shù)創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223301;2.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 江蘇 淮安 223300;3.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210046)

為了探討水稻感病基因型種質(zhì)響應(yīng)稻瘟病侵染的蛋白質(zhì)表達譜的變化規(guī)律和作用途徑,以水稻感稻瘟病種質(zhì)日本晴為材料,采用接種稻瘟病菌分生抱子懸浮液,24,48和72 h后提取葉片蛋白質(zhì),采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究稻瘟病脅迫下水稻葉片蛋白質(zhì)組的變化．結(jié)果表明,稻瘟病侵染誘導(dǎo)了水稻幼苗葉片內(nèi)涉及氧化還原平衡、防御、信號傳導(dǎo)、糖和能量代謝、氨基酸代謝、光合作用,以及蛋白質(zhì)代謝等代謝途徑相關(guān)的53個蛋白質(zhì)的表達量發(fā)生了改變．GO分析表明稻瘟病主要調(diào)控了植株體內(nèi)細胞內(nèi)平衡、代謝過程和蛋白質(zhì)代謝等生物學(xué)過程．稻瘟病侵染激活了活性氧代謝、防御,以及熱休克蛋白等相關(guān)的途徑,而抑制了蛋白質(zhì)生物合成過程．結(jié)合這些差異表達蛋白的豐度變化結(jié)合它們可能的功能,描繪了水稻應(yīng)答稻瘟病侵染的蛋白質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò),有助于在蛋白質(zhì)水平上了解其應(yīng)答過程．

水稻稻瘟病; 差異表達蛋白質(zhì); 代謝途徑; iTRAQ技術(shù)

0 引言

關(guān)于水稻抗稻瘟病相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道目前尚不多見．Kim 等人[1]以萌發(fā)的稻瘟病菌分生孢子及附著胞正在形成時的分生孢子為實驗材料進行的,結(jié)果鑒定了5個新的稻瘟病菌差異表達蛋白,并且進一步研究了差異表達蛋白在附著胞形成過程中的作用．謝娟等[2]發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌侵染后抗性品種出現(xiàn)了一個表達量非常大的新蛋白．通過分析感抗品種對稻瘟病菌不同的生理學(xué)反應(yīng)可以推測,這個新蛋白與其他表達量增加的蛋白點一樣與水稻受稻瘟病菌侵染后引起的應(yīng)答反應(yīng)相關(guān),是稻瘟病菌侵染后由無毒基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的新的功能性蛋白．朱永生等[3]研究了水稻葉鞘接種親和與非親和稻瘟病菌株不同時間的蛋白質(zhì)表達差異,結(jié)果表明,接種親和與非親和菌株后,水稻葉片具有相似的也有不同的蛋白質(zhì)表達差異．并且這些差異無論是在各個處理時間之間內(nèi)還是在各個處理之間都存在一定的規(guī)律性．縱向的比較分析表明,由非親和反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性蛋白質(zhì)在數(shù)量與表達量上均要高于由親和反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)．上述以雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的蛋白組學(xué)研究有助于在蛋白質(zhì)水平上了解水稻水稻稻瘟病抗性的分子機制．目前,基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用為開展植物重要性狀的分子機制的研究提供了一種新的平臺．該技術(shù)在蛋白質(zhì)分離的數(shù)目和定量的準確性等方面具有更大的優(yōu)勢[4]．

本文利用基于同位素相對標記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了水稻感病種質(zhì)日本晴幼苗葉片在受稻瘟病菌侵染后的差異蛋白質(zhì)表達譜的變化,發(fā)掘出稻瘟病誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變化規(guī)律,同時通過生物信息學(xué)技術(shù)分析了上述差異表達蛋白的生物學(xué)過程、分子功能和細胞定位,并對上述稻瘟病應(yīng)答蛋白參與的分子網(wǎng)絡(luò)進行了發(fā)掘．

1 材料與方法

1.1 水稻幼苗培養(yǎng)和稻瘟病菌侵染

實驗選用的水稻材料為感病種質(zhì)日本晴,在智能人工氣候箱中用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng),晝/夜溫度分別為28℃和26℃,相對濕度為 70%～80%．當幼苗長至1葉1心時,進行噴霧接種處理．所接種的稻瘟病病菌菌株為淮安本地的稻瘟病菌混合生理小種．對照材料是在水稻幼苗的葉片上均勻噴霧接種緩沖液,接菌處理株則是在葉片上噴霧接種．在接種后的第24,48和72 h取樣．每個樣品設(shè)置3個重復(fù)．

1.2 蛋白質(zhì)的提取

水稻幼苗葉片在液氮中研磨,按照1:10(W/V)加入裂解液(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%CHAPS),渦旋混勻．室溫下超聲60 s,浸提30 min．然后在10℃下，14 000 rpm,離心1 h,小心取出上清液,并用Bio-Rad 蛋白定量試劑盒進行定量．上清液分裝后凍存于-80℃．

1.3 蛋白質(zhì)酶解和iTRAQ標記

取200 μg蛋白溶液置于離心管中,加入4 μL還原試劑,60℃反應(yīng)1 h,加入2 μL半胱氨酸-阻斷劑,室溫10 min．將還原烷基化后的蛋白溶液加入超濾管中,12 000 rpm離心20 min,棄掉收集管底部溶液．加入iTRAQ試劑盒中的溶解液100 μL,12 000 rpm離心20 min,棄掉收集管底部溶液,重復(fù)3次,更換新的收集管,在超濾管中加入胰蛋白酶,總量4 μg(與蛋白質(zhì)量比1:50),體積50 μL,37℃反應(yīng)過夜．12 000 rpm離心20 min,酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部．再加入50 μL溶解液,12 000 rpm離心20 min,與上步合并,收集酶解后的樣品．

從冰箱中取出iTRAQ試劑,平衡到室溫,將iTRAQ試劑離心至管底．向每管iTRAQ試劑中加入150 μL異丙醇,渦旋振蕩,離心至管底．取50 μL樣品,將iTRAQ試劑填加到樣品中,渦旋振蕩,離心至管底,室溫反應(yīng)2 h．然后加入100 μL水終止反應(yīng)．其中對照樣品、24，48和72 h的樣品分別用113、114、115和116進行標記．

1.4 酶解肽段的分離、LC-MS/MS質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定

酶解肽段的分離、LC-MS/MS質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定參考zhu等[5]人的方法,并作簡要修改,混合標記后的樣品用50 μL流動相A(98%H2O,2%乙腈,pH 10)溶解,14 000 rpm離心20 min,取上清液待用．取50 μL準備好的樣本進樣．用流動相B(98%乙腈,2% H2O,pH 10),洗脫,流速為0.7 mL/min．根據(jù)紫外監(jiān)測情況,將RP分離得到的組份合并為10個,合并時采用30 μL 2% ACN,0.1% FA,加入第一個離心管,渦旋振蕩并離心后,轉(zhuǎn)入第二個離心管,依次直至合并組份最后一管．上述分級后的多肽樣品經(jīng)12 000 rpm離心10 min,吸取上清液進行LC分離和MS/MS(AB Sciex TripleTOFTM5600)分析．質(zhì)譜數(shù)據(jù)用ProteinPilot 4.0軟件檢索本地化的水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫．

1.5 差異表達蛋白的生物信息學(xué)分析

使用Pfam數(shù)據(jù)庫[6]和InterPro數(shù)據(jù)庫[7]進行差異蛋白的功能分類．對于注釋為未知或假定的蛋白的身份,在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行同源蛋白檢索．使用iProClass Gene Ontology進行差異表達蛋白質(zhì)所參與的生物學(xué)過程、涉及的分子功能和細胞內(nèi)定位的分析．

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病侵染后水稻幼苗葉片表型和稻瘟病浸染應(yīng)答蛋白質(zhì)表達譜的變化

在形態(tài)性狀方面,稻瘟病菌浸染后15天后水稻幼苗葉片出現(xiàn)了明顯的變化,葉片上出現(xiàn)了明顯的病斑,日本晴幼苗葉片表現(xiàn)出感病的表型．這與Ribot等[8]和Carrillo等[9]的報道類似,表明水稻材料日本晴是稻瘟病感病種質(zhì)．

用iTRAQ方法檢測稻瘟病侵染水稻幼苗葉片引起的差異表達的蛋白質(zhì),通過比較稻瘟病侵染后的幼苗葉片與對照材料的蛋白質(zhì)表達量的相對變化,檢測到53個蛋白質(zhì)在稻瘟病菌侵染前后表現(xiàn)出2倍以上的變化(p<0.05)(表1)．稻瘟病侵染引起了水稻幼苗葉片蛋白質(zhì)表達豐度的上調(diào)或下調(diào),根據(jù)差異表達蛋白的豐度變化趨勢,差異蛋白的變化譜大致可以分為三類,類I為受稻瘟病菌侵染蛋白質(zhì)表達豐度上調(diào)的類群,類II為受稻瘟病菌侵染蛋白質(zhì)表達豐度上調(diào)后再下調(diào)的類群,類III為受稻瘟病菌侵染蛋白質(zhì)表達豐度下調(diào)的類群(圖1)．這種趨勢與在轉(zhuǎn)錄水平上檢測到的情況有部分類似[10]．

表1 水稻應(yīng)答稻瘟病侵染的差異表達蛋白質(zhì)

圖1 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質(zhì)的聚類分析

2.2 差異表達蛋白的鑒定和功能分類

響應(yīng)稻瘟病侵染的53個差異表達的蛋白質(zhì)在植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行同源比對,50個蛋白質(zhì)具有明確的功能,3個蛋白質(zhì)被注釋為未知的蛋白(表1)．基于水稻幼苗葉片的代謝與功能特征,這些蛋白質(zhì)分為主要的9個類群,包括防御/抗性蛋白、氧化還原、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、糖代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、蛋白質(zhì)折疊與組裝、氨基酸代謝,以及未知蛋白(圖2)．其中所占比重最大的三個功能類群是防御/抗性蛋白、氧化還原和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),說明稻瘟病侵染引起了水稻幼苗葉片的自身防御系統(tǒng)的響應(yīng),以及對侵害的一種反應(yīng)．

圖2 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質(zhì)的功能分類

2.3 差異表達蛋白的GO分析

為了進一步了解稻瘟病誘導(dǎo)的差異表達蛋白質(zhì)的功能,對差異表達的蛋白質(zhì)進行了生物學(xué)過程、分子功能和細胞內(nèi)定位的分析．稻瘟病調(diào)控的差異蛋白質(zhì)主要涉及到細胞內(nèi)平衡、代謝過程、脅迫應(yīng)答和蛋白質(zhì)修飾等生物學(xué)過程,同時也調(diào)控了光合作用、次生代謝、細胞生長和翻譯等過程(圖3A)．至于差異蛋白質(zhì)的分子功能分類方面,結(jié)合活性(包括RNA結(jié)合活性、蛋白質(zhì)結(jié)合活性和碳水化合物結(jié)合活性等)是最主要的一族,同時也涉及到水解酶活性、激酶活性、調(diào)控因子活性和結(jié)構(gòu)分子活性等(圖3B)．另外,這些差異表達蛋白質(zhì)的細胞定位主要在細胞核、細胞質(zhì)、質(zhì)體和線粒體等部位(圖3C)．上述結(jié)果表明稻瘟病侵染誘導(dǎo)了水稻幼苗葉片內(nèi)多個生物學(xué)過程,涉及到多樣化的分子功能和細胞內(nèi)區(qū)域．這種情況與Bagnaresi等人[10]在轉(zhuǎn)錄水平上獲得稻瘟病誘導(dǎo)的早期應(yīng)答的差異表達基因結(jié)果類似．

圖3 稻瘟病菌侵染水稻葉片后差異表達蛋白質(zhì)的GO分析

2.4 差異表達蛋白涉及到葉片的抗氧化系統(tǒng)的應(yīng)答

響應(yīng)稻瘟病菌侵染的差異表達的蛋白質(zhì)中有26個蛋白質(zhì)是與葉片抗氧化反應(yīng)相關(guān),這些蛋白質(zhì)可以分成4類,包括脅迫防御、氧化還原平衡,信號傳導(dǎo)和氨基酸代謝(表1)[11]．在7個脅迫防御類的差異蛋白中,5個蛋白質(zhì)(胰蛋白酶抑制劑,DREPP2蛋白,病程相關(guān)蛋白Bet v I,profilin A 蛋白,類索馬甜蛋白)在稻瘟病菌侵染的葉片中的豐度增加,2個蛋白質(zhì)(半胱氨酸蛋白酶抑制劑,TPR結(jié)構(gòu)域蛋白)的豐度降低(表1)．其中,病程相關(guān)蛋白Bet v I和類索馬甜蛋白是植物體內(nèi)的主要病程相關(guān)蛋白,受病原菌侵染后增強表達[12,13]．植物受到生物脅迫后,組織細胞內(nèi)的活性氧代謝和氧化還原平衡會受到影響,并進而通過該途徑傳遞脅迫的信號[14]．涉及氧化還原平衡的6個差異表達的蛋白質(zhì),包括氧爆發(fā)增強子蛋白,核氧化還原蛋白1-1,過氧化物酶,硫氧還蛋白M,過氧化氫酶前體等,在稻瘟病菌侵染后表達量都增加,表明水稻葉片感稻瘟病后,葉片內(nèi)的活性氧代謝被激活,并使活性氧的含量增加,進而加重了對葉片的傷害．

植物受到病原菌侵染后,會激發(fā)細胞內(nèi)的信號途徑以傳導(dǎo)脅迫的作用．特別是受體類激酶,往往是是植物感受病原菌侵染,傳遞脅迫信號的主要途徑．在稻瘟病菌侵染后檢測到SRP受體類蛋白,果糖激酶,磷酸核酮糖激酶表達豐度降低,而磷酸果糖激酶β亞基,類受體蛋白激酶,2-丁酮激酶受稻瘟病誘導(dǎo)豐度增加．由此表明,水稻感染稻瘟病后啟動了不同的信號途徑以傳導(dǎo)機體的免疫應(yīng)答．另外,與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)在稻瘟病菌侵染后表現(xiàn)出表達豐度的變化,包括類抗真菌蛋白、天冬氨酸合成酶、色氨酸合成酶1、S-腺苷甲硫氨酸合成酶2、苯丙氨酸解氨酶．上述這些結(jié)果顯示差異表達蛋白質(zhì)的豐度變化與總體的抗氧化防御應(yīng)答之間的關(guān)系在水稻葉片抗稻瘟病中發(fā)揮著重要作用．

2.5 差異表達蛋白涉及到光合過程、能量代謝和蛋白質(zhì)代謝

稻瘟病菌侵染誘導(dǎo)了與光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)的表達變化．光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II、原葉綠素酸脂還原酶B在稻瘟病菌侵染后豐度降低,暗示著葉綠體結(jié)構(gòu)受到傷害;而轉(zhuǎn)位酶SECY亞基、細胞色素b5還原酶的豐度增加,說明機體在光合過程受到抑制時,為了滿足體內(nèi)對能量的需求,光電子傳遞過程的應(yīng)激性反應(yīng)的提高．另外,稻瘟病菌侵染過程中,涉及到糖代謝和能量代謝的蛋白質(zhì)的豐度明顯增強(表1),表明機體需要消耗更多能量以應(yīng)對稻瘟病的傷害．

另外,稻瘟病菌侵染也誘導(dǎo)了與蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊和修飾等過程的改變．其中涉及到與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達譜在稻瘟病菌侵染后豐度降低,表明水稻葉片感稻瘟病后抑制了蛋白質(zhì)的合成．而涉及到蛋白質(zhì)折疊和修飾類的蛋白質(zhì)群的豐度卻明顯增強,暗示著稻瘟病誘導(dǎo)了水稻葉片內(nèi)更多的蛋白質(zhì)變化,需要折疊和修飾類的蛋白質(zhì)進行調(diào)控,進而增強了這類蛋白的表達．

3 結(jié)論

稻瘟病菌侵染感病基因型的水稻種質(zhì)后,誘導(dǎo)了水稻葉片內(nèi)強烈的應(yīng)激反應(yīng),特別是涉及到氧化還原平衡的蛋白質(zhì)群的表達譜變化和抗氧化防御類的蛋白質(zhì)的增強表達．同時,稻瘟病菌侵染也誘導(dǎo)了光合過程的蛋白質(zhì)的豐度改變,以及代謝類蛋白質(zhì)變化．這些結(jié)果描述了水稻葉片對稻瘟病的應(yīng)答策略,以及葉片內(nèi)發(fā)生的一系列事件．

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[責(zé)任編輯：蔣海龍]

Proteomic Analysis Reveals an Intimate Protein Pathways
Provoked by Blast in Rice Seedling Leaves

TANG Cheng1, CHEN Lu2,3, AN Min-min2, MENG Dan2, YANG Li-ming2, LUO Yu-ming2

(1.Hi-tech Innovation Center in Huaian City, Huaian Jiangsu 223301, China)(2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural and Biotechnology Around Hongze Lake/School of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)(3.School of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing Jiangsu 210046, China)

To investigate the responses of rice seedlings to blast infection, changes in protein expression were analyzed using a comparative proteomics approach. After infection of blast for 24h, 48h and 72h on two weeks old rice seedlings, 53 differentially expressed proteins were detected. These identified proteins are involved in different biochemical responses and metabolic processes with obvious functional tendencies toward redox homeostasis, defense, signal transduction, protein metabolism, photosynthesis, carbohydrate/energy metabolism, and amino acid metabolism. Gene Ontology analysis reveals primary metabolism, redox homeostasis and protein metabolism are the most highly affected biological processes by rice blast infection. The abundance changes of these proteins, together with their putative functions produce an protein pathways in response to blast infection at the protein level in rice seedling leaves. Such a protein network may contribute to further understand the possible strategy of cellular activities occurring in rice seedling leaves responding to blast infectioin.

rice blast; differentially expressed proteins; metabolic pathways; iTRAQ

2014-06-06

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目(CX[12]3048); 淮安市農(nóng)業(yè)科技支撐計劃項目(SN130127); 江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊資助項目

唐成(1982-),男,江蘇沭陽人,農(nóng)藝師,碩士,研究方向為水稻品質(zhì)與分子機理研究. E-mail: yumingluo@163.com

S184; S511

A

1671-6876(2014)04-0322-07