曹傳培

EMT與Ⅱ期結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

曹傳培

目的 探討E-cadherin、vimentin與Ⅱ期結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 選?、蚱诮Y(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者的組織切片，采用免疫組化技術(shù)檢測E-cadherin、vimentin的表達(dá)情況。結(jié)果 E-cadherin、vimentin表達(dá)與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論 E-cadherin、vimentin可能作為Ⅱ期CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。

Ⅱ期結(jié)直腸癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；預(yù)后

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1538～1539)

Ⅱ期(T3-4N0M0) CRC占全部CRC的40%，5年生存率為70%～85%，仍有近20%的Ⅱ期CRC患者在根治術(shù)后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[1-2]。TNM分期是判斷CRC預(yù)后的良好依據(jù)，因患者存在個體異質(zhì)性，所以即使同一分期的患者實行規(guī)范的治療后仍可能有不同的預(yù)后。而復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成Ⅱ期CRC預(yù)后差的主要原因，研究Ⅱ期CRC患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高危因素及相關(guān)分子標(biāo)記物可以補充分期系統(tǒng)的不足，并對基于腫瘤個體生物學(xué)特征的治療提供理論依據(jù)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的早期事件而受到廣泛關(guān)注。EMT是指在特定情況下上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。EMT可以破壞腫瘤細(xì)胞間連接，使細(xì)胞間粘附性減弱，遷移能力增強[3]。EMT重要標(biāo)志為E-cadherin表達(dá)下調(diào)及Vimentin表達(dá)上調(diào)。

本實驗旨在探索EMT在Ⅱ期CRC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用，為尋找結(jié)直腸癌診斷治療新靶點提供理論依據(jù)，并指導(dǎo)臨床個體化治療。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2003年1月-2007年12月在九江學(xué)院附屬醫(yī)院行根治術(shù)的Ⅱ期結(jié)直腸腺癌患者86例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，均為Ⅱ期；②術(shù)前未接受放化療；③接受標(biāo)準(zhǔn)根治性手術(shù)治療；④術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況明確；⑤病歷資料完整。

1.2 主要試劑

一抗：E-cadherin(SC-8426)及Vimentin(BM0135)購自武漢博士德公司，DAKO Real Envision anti mouse/rabbit 二抗檢測系統(tǒng)購自基因公司，進(jìn)口羊血清工作液、一抗稀釋液購自中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

采用Envision法檢測E-cadherin、vimentin的表達(dá)，將組織切片以4 μm厚度切片置于60 ℃恒溫箱過夜；二甲苯常規(guī)透明后以100%-100%-95%-95%-90%-80%-70%各級乙醇浸泡10 min,超純水浸泡5 min；高溫高壓抗原修復(fù)，從排氣閥開始排氣時算起3 min，自然冷卻；超純水浸泡2次，PBS浸泡2次，3 min/次，以洗去修復(fù)液；免疫組化油筆圈住組織防漏，3%過氧化氫室溫封閉10 min；放入PBS浸洗3次，5 min/次；滴加封閉血清封閉10 min；

一抗孵育：用吸水紙吸去血清，加稀釋的一抗溶液(1∶100)，37 ℃孵育1 h；傾去一抗，PBS浸洗3次，5 min/次；滴加Dako二抗，將組織完全覆蓋，平放于濕盒，室溫孵育30 min；傾去二抗，PBS浸洗3次，5 min/次；DAB顯色；蘇木精復(fù)染2 min，超純水中返藍(lán)1 h；70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%乙醇；二甲苯透明10 min；中性樹膠封片；光鏡下觀察結(jié)果。

1.4 免疫組化染色結(jié)果觀察及判斷

采用光鏡下半定量法對陽性細(xì)胞染色強度及范圍進(jìn)行判定：以染色強度分為：無(0分)；淺黃色(1分)；棕黃色(2分)；棕褐色(3分)。以陽性細(xì)胞數(shù)比例分為：陰性(0分)，<10%(1分)，10%～50%(2分)，51%～75%(3分)，76%～100%(4分)。免疫組化染色結(jié)果為上述兩項評分之積，<6分為低表達(dá)組，≥6分為高表達(dá)組(Vimentin表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)，將計數(shù)陽性細(xì)胞比例改變?yōu)楣浪汴栃约?xì)胞表達(dá)面積百分比，計分方法同上)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；分析各分子表達(dá)量與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系采用卡方檢驗；以α=0.05(雙側(cè))為標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

在制作免疫組化染色過程中，出現(xiàn)掉片、卷片等不可評價共5例，這5例樣本無法完成分子指標(biāo)檢測，最后納入分析的病例共81例。

2.1 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況

在統(tǒng)計的81例患者中，16例(19.8%)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。根治術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率占56.3%(9/16)，3年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移占87.5%(14/16)。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中位時間為20個月。

2.2 E-cadherin、vimentin在Ⅱ期CRC 中表達(dá)情況

E-cadherin在CRC腫瘤組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或胞質(zhì)、胞膜混合表達(dá)，腫瘤組織中其表達(dá)率為53.1%(43/81)，高表達(dá)者占16%(13/81)，低表達(dá)者占84%(68/81)。Vimentin表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)，表達(dá)率為64.2%(52/81)，高表達(dá)者占40.7%(33/81)，低表達(dá)者占59.3%(48/81)。

2.3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與E-cadherin、vimentin表達(dá)的關(guān)系

以復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為終點事件，采用單因素卡方檢驗分析術(shù)后各分子表達(dá)量與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，分析得出腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與E-cadherin(P=0.009)、vimentin(P=0.048)表達(dá)有關(guān)，見表1。

表1 各分子表達(dá)情況與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系/例

3 討論

EMT重要標(biāo)志為E-cadherin表達(dá)下調(diào)，E-cadherin屬于I型鈣粘蛋白，介導(dǎo)鈣離子依賴性的同型上皮細(xì)胞間的黏附,限制細(xì)胞的隨意運動[4]。E-cadherin表達(dá)水平下降、喪失或分布異常,有利于腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[5]。Xiaobing等[6]研究顯示E-cadherin在維持細(xì)胞間粘附性有重要作用，若E-cadherin表達(dá)缺失，會增加CRC細(xì)胞的侵襲性。

EMT另一個重要標(biāo)志是波形蛋白(vimentin)表達(dá)上調(diào)，vimentin是由310個氨基酸殘基組成的III型中間纖維絲蛋白，與微管、微絲共同組成細(xì)胞骨架以維持細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，參與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、凋亡。研究表明vimentin選擇性高表達(dá)于侵襲性強的乳腺癌細(xì)胞中，并且與細(xì)胞角蛋白呈正相關(guān)性[7]。在惡性黑色素瘤和前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)vimentin的過表達(dá)與腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)[8-9]。

綜上所述，探尋更多復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)腫瘤標(biāo)志物對于監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后及個體化治療非常重要，若能提前干預(yù)可以減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，對于提高Ⅱ期CRC總生存有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin、vimentin可能作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。

[1] Wolpin BM,Mayer RJ.Systemic treatment of colorectal cancer〔J〕.Gastroenterology,2008,134(5):1296-1310.

[2] Gill S,Loprinzi CL,Sargent DJ,et al.Pooled analysis of fluorouracil-based adjuvant therapy for stage Ⅱ and Ⅲ colon cancer:who benefits and by how much〔J〕.J Clin Oncol，2004,22(10):1797-1806.

[3] Yilmaz M,Christofori G.EMT,the cytoskeleton,and cancer cell invasion〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2009,28(1-2):15-33.

[4] Conacci-Sorrell M,Zhurinsky J,Ben-Ze'ev A.The cadherin-catenin adhesion system in signaling and cancer〔J〕.J Clin Invest,2002,109(8):987-991.

[5] Chen X,Wang Y,Xia H,et al.Loss of E-cadherin promotes the growth,invasion and drug resistance of colorectal cancer cells and is associated with liver metastasis〔J〕.Mol Biol Rep,2012,39(6):6707-6714.

[6] Herrmann H,Hesse M,Reichenzeller M,et al.Functional c- omplexity of intermediate filament cytoskeletons:from structure to assembly to gene ablation〔J〕.Int Rev Cytol,2003,223:83-175.

[7] Thomas PA,Kirschmann DA,Cerhan JR,et al.Association between keratin and vimentin expression,malignant phenotype,and survival in postmenopausal breast cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,1999,5(10):2698-2703.

[8] Singh S,Sadacharan S,Su S,et al.Overexpression of vimentin:role in the invasive phenotype in an androgen-independent model of prostate cancer〔J〕.Cancer Res,2003,63(9):2306-2311.

[9] Brabletz T,Hlubek F,Spadena S,et al.Invasion and metastasis in colorectal cancer:epithelial-mesenchymal transition,mesenchymal-epithelial transition,stem cells and b-catenin〔J〕.Cells Tissues Organs,2005,179(1-2):56-65.

(編輯：吳小紅)

Correlation Research between EMT and Recurrence and Metastasis of Stage ⅡColorectal Cancer

CAOChuanpei.

JiujiangUniversityHospital,Jiujiang,332000

Objective To explore the relationship between E-cadherin,vimentin and recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer.Methods Expression of E-cadherin and vimentin in stage Ⅱ colorectal cancer patients with and without recurrence and metastasis were detected by immunohistochemical technique.Results Multivariate analysis showed that the recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer was significantly associated with E-cadherin and vimentin expression (P<0.05).Conclusion E-cadherin and vimentin may be used as a molecular biomarker for predicting the recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer.

Stage Ⅱ colorectal cancer；Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)；Recurrence and metastasisⅡPrognosis

332000 九江學(xué)院附屬醫(yī)院普外科

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.009

R735.3+7

A

1001-5930(2014)12-1538-02

2014-09-17

2014-10-30)