陳文學(xué) 鄒學(xué)森 李金高 龔小昌 袁 霞 敖 帆

血漿EB病毒DNA檢測(cè)對(duì)鼻咽癌診斷的價(jià)值研究

陳文學(xué) 鄒學(xué)森 李金高 龔小昌 袁 霞 敖 帆

目的 探討血漿 EB病毒水平對(duì)鼻咽癌的診斷價(jià)值。方法 收集112例鼻咽癌初診患者外周血,分離血漿,應(yīng)用熒光定量 PCR法檢測(cè) EB病毒 DNA。結(jié)果 血漿中EB病毒DNA陽(yáng)性率與患者性別無(wú)相關(guān)性。30-60歲鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA陽(yáng)性率明顯高于60歲以上者(P<0.05)。鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA陽(yáng)性率為74.11%，隨著鼻咽癌患者臨床分期增加，血漿中EB病毒DNA陽(yáng)性亦增強(qiáng)。結(jié)論 血漿EB病毒DNA水平與鼻咽癌患者臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系，血漿EB病毒DNA的檢測(cè)可以輔助鼻咽癌的診斷。

鼻咽癌;Epstein-Barr病毒;DNA

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1526～1528)

EB病毒感染是鼻咽癌的發(fā)生的高危因素，眾多研究顯示鼻咽癌組織和鼻咽癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中均可檢出EB病毒[1]。1998年Mutirangura等[2]報(bào)道鼻咽癌患者外周血中可以檢測(cè)到EB病毒DNA，且拷貝數(shù)明顯高于正常人。外周血EB病毒DNA檢測(cè)可能成為鼻咽癌早期診斷的一種方法。我們運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)江西省112例鼻咽癌初診患者血漿中游離EB病毒DNA，分析在鼻咽癌診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2012年3月-2013年12月本院收治的鼻咽癌初治患者112例,平均年齡 48.5 (21～72)歲。全部患者經(jīng)鼻咽活檢病理證實(shí)為鼻咽癌，病理類(lèi)型均為低分化鱗癌。所有患者均接受鼻咽、頸部CT掃描，電子鼻咽鏡及胸部正側(cè)位片，腹部B超及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查以明確分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，若患者有骨痛癥狀則行全身骨掃描。臨床分期按92分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。

抽取患者2 ml外周血置于 EDTA抗凝管，全血經(jīng)3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心，分離獲得血漿，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

EB病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，熒光定量核酸擴(kuò)增儀( 達(dá)安基因DA7600)。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 嚴(yán)格按照EB病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行DNA提取。取50 μl血漿置滅菌管中，加入50 μl DNA提取液，充分混勻，100℃恒溫處理(10±1) min，4℃過(guò)夜，次日12 000轉(zhuǎn)離心5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物探針及反應(yīng)體系 所擴(kuò)增的目的片段來(lái)自EB病毒的EBNA-1片段。上游引物，下游引物及探針由達(dá)安基因試劑盒自帶，探針序列5′標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)FAM，3′標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

1.3.3 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置 93 ℃，2 min；93 ℃，45 s，55 ℃，60 s，10個(gè)循環(huán)；93 ℃，30 s，55 ℃，45 s(采集熒光信號(hào))，30個(gè)循環(huán)。

1.3.4 反應(yīng)的質(zhì)量控制 每次操作都做EBV陰性質(zhì)控品，EBV臨界陽(yáng)性質(zhì)控品，EBV強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品，定量參考品(107IU/ml,106IU/ml,105IU/ml,104IU/ml，103IU/ml)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，EBV陰性質(zhì)控品為陰性，EBV臨界陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品在質(zhì)控范圍內(nèi)，定量參考品的相關(guān)系數(shù)在0.98以上，此實(shí)驗(yàn)有效，如果有一項(xiàng)不在范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)無(wú)效，重做。

1.3.5 判斷標(biāo)準(zhǔn) 所有定量結(jié)果分為四個(gè)等級(jí)，陰性≤500 IU/ml，弱陽(yáng)性501～20 000 IU/ml，陽(yáng)性20 001～1 000 000 IU/ml,強(qiáng)陽(yáng)性≥1 000 001 IU/ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同性別組、年齡組中鼻咽癌患者EB病毒陽(yáng)性率的比較用卡方檢驗(yàn)，鼻咽癌患者EB病與臨床分期的相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在每個(gè)循環(huán)檢測(cè)一次熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的多少與PCR的產(chǎn)物量呈正相關(guān)關(guān)系。PCR反應(yīng)結(jié)束后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀會(huì)自動(dòng)給出PCR擴(kuò)增的動(dòng)力曲線(圖1)及定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別為107、106、105、104、103IU/ml(圖2)。圖2中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.42，相關(guān)系數(shù)為0.999。

圖1 PCR擴(kuò)增的動(dòng)力曲線

2.2 EB病毒感染與鼻咽癌與鼻咽癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系

112例鼻咽癌初診患者中年齡最大的72歲，最小的21歲，40～49歲占34.82%(39/112)，其次為50～59歲占26.79%(30/112)。由表1可見(jiàn)，鼻咽癌初診患者的年齡與EB病毒感染率有顯著相關(guān)性(χ2=17.799P=0.001)。進(jìn)行各年齡組兩兩比較，結(jié)果50～59歲組EB病毒陽(yáng)性率明顯高于60～69歲組，40～49歲組與60～69歲組比較(χ2=7.163P=0.007)、50～59歲與60～69歲組比較(矯正χ2=15.386P=0.0000)EB病毒的陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

圖2 PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

男性鼻咽癌初治患者的EB病毒陽(yáng)性率與女性相比無(wú)顯著性差異(χ2=0.19,P=0.663)。

表1 鼻咽癌初診患者年齡對(duì)EB病毒感染的影響/例

2.3 鼻咽癌初診患者EB病毒陽(yáng)性與其臨床分期的關(guān)系

112例鼻咽癌初診患者外周血EB病毒陽(yáng)性率為74.11%(89/112)，其中強(qiáng)陽(yáng)性16例(14.29%)，陽(yáng)性47例(41.92%)，弱陽(yáng)性20例(18.76%)。最高拷貝數(shù)為大于1×107，中位拷貝數(shù)為4.05×105。所有鼻咽癌初診患者按照92分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了TNM分期(表2)。Ⅰ期與Ⅱ期，Ⅲ期與Ⅳ期鼻咽癌患者外周血EB病毒陽(yáng)性率比較均無(wú)顯著性差異，Ⅰ期與Ⅲ期(Fisher's Exact TestP=0.0013)、Ⅰ期與Ⅳ期(Fisher's Exact TestP=0.002)、Ⅱ期與Ⅲ期(矯正χ2= 6.973,P=0.008)、Ⅱ期與Ⅳ期(矯正χ2=7.285,P=0.007)比較均有顯著性差異。將Ⅰ期和Ⅱ期歸類(lèi)為早期鼻咽癌，Ⅲ期和Ⅳ期歸類(lèi)為晚期鼻咽癌，經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ⅲ期和Ⅳ期外周血EB病毒陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期(矯正χ2=17.56,P=0.000)。對(duì)鼻咽癌患者臨床TNM分期與外周血EB病毒含量做Spearman相關(guān)秩和檢驗(yàn)(γ=0.345,P=0.000)，結(jié)果說(shuō)明鼻咽癌患者TNM分期與外周血EB病毒含量呈正相關(guān)關(guān)系。

表2 不同臨床分期鼻咽癌患者外周血EB病毒 DNA水平

3 討論

熒光定量 PCR技術(shù)是近年來(lái)新興的分子診斷方法。它具有常規(guī)PCR的高靈敏性，克服了常規(guī)PCR 技術(shù)不能定量以及易污染的問(wèn)題。熒光定量 PCR技術(shù)運(yùn)用了熒光探針，可以直接探測(cè)到PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)定量。

我們應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)江西省內(nèi)鼻咽癌初治患者血漿中EB病毒DNA，結(jié)果顯示鼻咽癌患者的陽(yáng)性率為74.11%。Lo[3]運(yùn)用熒光定量PCR方法檢測(cè)了57例鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA，55例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率96%。Shotelersuk[4]運(yùn)用巢式PCR方法檢測(cè)167例鼻咽癌患者，87例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為52.1%。產(chǎn)生這種差異的可能原因?yàn)槿虢M患者分期比例不同，使用的檢測(cè)方法不同，不同地區(qū)鼻咽癌患者EB病毒感染特征不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，EBV DNA陽(yáng)性率男女之間無(wú)顯著性差異。30歲到60歲三個(gè)年齡組之間EB病毒DNA無(wú)顯著性差異，40～歲組與60～歲組EB病毒的陽(yáng)性率比較時(shí)P值接近檢驗(yàn)水準(zhǔn)，50～歲組EB病毒的陽(yáng)性率明顯高于60～歲組。文獻(xiàn)報(bào)道在鼻咽癌高發(fā)地區(qū)健康人群中EBV DNA感染與性別、年齡之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。我們的研究結(jié)果顯示鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA年齡分布特征與鼻咽癌的人群年齡分布(20～40歲開(kāi)始上升，40～60歲達(dá)到發(fā)病高峰)很相似，這也提示EB病毒感染與鼻咽癌的發(fā)生有密切關(guān)系，EB病毒感染是鼻咽癌發(fā)生的高危因素。究竟EB病毒感染在鼻咽癌發(fā)生中起了多少作用，EB病毒感染是從幼年開(kāi)始，鼻咽癌發(fā)病是成年以后，在這漫長(zhǎng)的過(guò)程中EB病毒是怎樣導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的還有待于進(jìn)一步研究。

本研究中分析了鼻咽癌患者血漿中 EBV DNA的含量與鼻咽癌分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，血漿中EBV DNA與鼻咽癌患者臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系，晚期鼻咽癌的EB 病毒含量明顯高于早期鼻咽癌患者。EB病毒在宿主細(xì)胞中有兩種存在方式，EB病毒或插入宿主細(xì)胞染色體中或以環(huán)狀分子游離于細(xì)胞DNA之外。鼻咽癌病人腫瘤細(xì)胞來(lái)源的EB病毒DNA釋放入血的機(jī)制目前尚不十分清楚。Chan等[5]研究發(fā)現(xiàn)血漿中EBV DNA不是完整的病毒顆粒而是裸露的DNA片斷，故推測(cè)血漿EBV DNA是由壞死的腫瘤細(xì)胞釋放入外周血。有學(xué)者認(rèn)為鼻咽癌患者血清EBV DNA水平與腫瘤組織細(xì)胞凋亡有正相關(guān)性，提示外周血游離的EB病毒DNA是凋亡的腫瘤細(xì)胞釋放的。買(mǎi)世娟報(bào)道早期和晚期患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞EB病毒陽(yáng)性率分別為76.19%(16/21)和73.42%(58/79)，無(wú)明顯差異，但血清/血漿EB病毒陽(yáng)性率分別為61.9%(13/21)和88.61%(70/79)，有明顯差異，提示血清/血漿中檢測(cè)到的EB病毒DNA是來(lái)源于腫瘤組織，并與局部腫瘤負(fù)荷有關(guān)。我們的研究結(jié)果說(shuō)明隨著鼻咽癌的進(jìn)展(腫瘤體積的增大或腫瘤轉(zhuǎn)移)血漿中 EBV DNA的陽(yáng)性率亦增高，血清/血漿中檢出的游離的EB病毒DNA可能來(lái)源于含有EB病毒的腫瘤細(xì)胞或單核/巨噬細(xì)胞破裂而釋放病毒進(jìn)入血循環(huán)。

綜上所述血漿中EBV DNA水平增高與鼻咽癌臨床分期、腫瘤負(fù)荷及病情相關(guān)。血漿EB 病毒 DNA定量檢測(cè)可作為鼻咽癌診斷的手段之一。

[1] 蔣衛(wèi)紅，趙素萍，尹志華，等.定量和定位檢測(cè)EB病毒在鼻咽癌組織中的感染狀態(tài)〔J〕.癌癥,2005,24(7):796-800.

[2] Mutirangura A,Pornthanakasem W,Theamboonlers A,et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,1998,4(3):665-669.

[3] Lo YM,Chan LY,Lo KW,et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma 〔J〕.Cancer Res,1999,59(6):1188-1191.

[4] Shotelersuk K,Khorprasert C,Sakdikul S,et al.Epstein-Barr Virus DNA in Serum/Plasma as a Tumor Marker for Nasopharyngeal Cancer 〔J〕.Clin Cancer Res,2000,6(3):1046-1051.

[5] Chan KC,Zhang J,Chan AT,et al.Molecular characterization of circulating EBV DNA in the plasma of nasopharyngeal carcinoma and lymphoma patients 〔J〕.Cancer Res,2003,63(9):2028-2032.

(編輯：吳小紅)

Detection of EB Virus in Plasma in the Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma

CHENWenxue,ZOUXuesen,LIJingao,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To explore the diagnostic value of Epstein-Barr virus (EBV) DNA in plasma in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Real time quantitative PCR was used to detect EBV DNA in plasma of 112 cases of first diagnosed nasopharyngeal carcinoma.Results EBV DNA positive rate of NPC had no correlation with gender.The EBV DNA positive rates of patients from 30 to 60 years old were higher than those of patients over 60(P<0.05).EBV DNA positive rate in NPC plasma was 74.11%.With the increase of NPC clinical stage,the EBV DNA positive rate increased.Conclusion The EBV DNA level of plasma and NPC clinical stage has a positive relationship.Detection of plasma EBV DNA is useful for the diagnosis of NPC.

Nasopharyngeal carcinoma (NPC);Epstein-Barr virus (EBV);DNA

330029 江西省腫瘤醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.005

R739.62

A

1001-5930(2014)12-1526-03

2014-08-21

2014-09-28)