高 巖 姜 浩 孫治國(guó) 高 健

EP4在結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29增殖中的作用

高 巖 姜 浩 孫治國(guó) 高 健

目的 探討PGE2誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29增殖和凋亡的機(jī)制，明確以EP4為靶點(diǎn)治療結(jié)腸癌的作用途徑。方法 將EP4抑制劑L161982按不同濃度作用于結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29，用MTT(四甲基偶氮唑藍(lán)比色法)法分別于作用12、24、48、72 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步采用Western Blot法檢測(cè)Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 EP4抑制劑L161982對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29呈時(shí)間、劑量依賴性方式抑制細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著L161982劑量增加，HT29細(xì)胞凋亡增強(qiáng)；凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)水平隨L161982劑量增加而升高。結(jié)論 PGE2可能通過(guò)EP4受體作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)Caspase-3途徑影響結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖與凋亡，這可能是結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

前列腺素E2；前列腺素E受體4；HT29

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1518～1521)

4種受體中EP4在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29存在量最大，EP4 通過(guò)與刺激型 G 蛋白(Gs)結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶，并且提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及增殖，抑制EP4能夠降低結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖[4]，但具體作用機(jī)制尚不明確。有研究表明，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中PGE2途徑失調(diào)誘發(fā)多種致癌信號(hào)，從而促進(jìn)癌變[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PGE2及其受體是惡性腫瘤病理生理過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在結(jié)腸癌的進(jìn)展過(guò)程中起重要作用，對(duì)它的作用機(jī)制的研究及相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)將是相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT29(牡丹江醫(yī)學(xué)院傳代培養(yǎng))，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，流式檢測(cè)凋亡試劑盒AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit I(BD 上?；蚬?，Caspase-3 兔抗人多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體(SANTA上海中杉公司)、Fas兔抗人多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠二抗IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗IgG，EP4抑制劑L161982(Cayman Chemical)。細(xì)胞培養(yǎng)所用儀器及Western blot 所使用試劑及儀器均為牡丹江醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

分為 5組：正常對(duì)照組(Control組)，常規(guī)方法培養(yǎng)；L161982不同劑量組 (Ll、L2、L3、L4組)：加入L161982于 DMEM 培養(yǎng)基，使其終濃度分別為10、30、60、120 μM，常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，每培養(yǎng)3～5 d傳代 1次；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)[6]。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT29細(xì)胞，經(jīng)過(guò)處理制成混懸液后接種于96孔板內(nèi)，每孔均加入細(xì)胞懸液 200 μL，細(xì)胞最佳接種密度為 2.5×10/L，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁，吸去原培養(yǎng)液后按不同組別處理加入培養(yǎng)基(每孔200 μL)；以 DMEM 培養(yǎng)液作為空白對(duì)照孔，以含 0.1% 二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。取分別處理培養(yǎng)第12、24、48、72 h為檢測(cè)點(diǎn)。于檢測(cè)點(diǎn)時(shí)間每孔加入無(wú)菌MTT溶液20 μL，繼續(xù)在原條件下CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后每孔再加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，在酶標(biāo)儀上測(cè)出各孔的A值。抑制率=(陰性對(duì)照組 A 值-實(shí)驗(yàn)組 A 值)/陰性對(duì)照組A值×100%。

通過(guò)政策的支持，河北省特色農(nóng)產(chǎn)品先后通過(guò)淘寶、京東等電商企業(yè)平臺(tái)，將農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行銷售，帶動(dòng)河北省特色農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展，提升其品牌知名度。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 參照Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。細(xì)胞不同分組處理培養(yǎng)48 h后，每組收集1×106個(gè)細(xì)胞,冷PBS 洗滌 2 次,1 000 r/ min 離心,棄上清。將細(xì)胞重懸于1 mL 1×binding buffer,取100 μL 細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀專用試管中,加5 μL AnnexinV FITC 和10 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μL 1×binding buffer，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，CellQuest軟件分析結(jié)果。

1.3.4 采用 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá) HT29細(xì)胞,經(jīng)不同分組處理后,提取總蛋白,測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度。等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳,轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至硝酸纖維素膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,用鼠多克隆抗Caspase-3抗體在5%的脫脂奶粉中4 ℃過(guò)夜。二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體，室溫1 h,最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)自顯影顯像在膠片上,膜用洗脫液洗脫后檢測(cè)β-actin的表達(dá)。應(yīng)用Gel-pro Analyzer 4.0圖像分析軟件，測(cè)得目的蛋白條帶積分光密度值，以各組β-actin條帶的積分光密度值對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)化。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

所有影像用Scion Image 軟件量化處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Statview軟件的單因素方差分析(One-wayANOVA)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)HT29細(xì)胞的增殖抑制率(MTT比色測(cè)定法)

2.1.1 不同劑量組同一時(shí)間點(diǎn)比較 與對(duì)照組比較，各劑量組細(xì)胞的增殖抑制率在藥物干預(yù)第 12、24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，有顯著性差異 (P<0.05)；L2、3、4組與前一組比較，細(xì)胞增殖抑制率有顯著性差異 (P>0.05)，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明抑制EP4能夠抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29的生長(zhǎng)增殖，且抑制率隨著抑制劑劑量增大而升高，呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)性。

2.1.2 同一劑量組不同時(shí)間點(diǎn)比較 與對(duì)照組相比，除 Ll組外其余3組抑制率均有不同程度增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；L2、3、4組作用24 h的抑制率明顯增高，與12 h時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；其后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步升高，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明L161982的增殖抑制作用隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，存在較明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。

圖1 MTT比色法測(cè)定HT29細(xì)胞的增殖抑制率

2.2 各組HT29細(xì)胞凋亡率

L2、3、4劑量組培養(yǎng)第24h檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,contro1組HT29細(xì)胞極少發(fā)生凋亡,L2、3、4組細(xì)胞凋亡率明顯增高，與 control組比較存在顯著差異(P<0.05，n=3)，L4組凋亡最明顯,見(jiàn)圖2。

2.3 Caspase-3蛋白的表達(dá)

Caspase-3在contro1組HT29細(xì)胞中表達(dá)水平較低；L161982各劑量組Caspase-3表達(dá)水平均明顯上調(diào)，與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05，n=3),其中L4組的表達(dá)水平最高，提示L161982可有效增加Caspase-3蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖3。

圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HT29細(xì)胞凋亡情況

圖3 L161982對(duì)HT29細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響

3 討論

研究表明，PGE2及其受體是惡性腫瘤增殖轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[7-8]，最新研究中有科學(xué)家表明EP4受體在腫瘤的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-11]。本實(shí)驗(yàn)探討了EP4受體在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中的作用，對(duì)PGE2 受體的研究將為治療結(jié)腸癌更加特異的治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及抗腫瘤藥物的治療中起著重要作用，細(xì)胞凋亡啟動(dòng)和執(zhí)行的發(fā)生過(guò)程受到精確調(diào)控，存在于細(xì)胞漿中的Caspases家族蛋白啟動(dòng)和執(zhí)行凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子為Caspase-3[6,12-13]。

本研究首先采用MTT法來(lái)觀察L161982對(duì)HT29細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在藥物干預(yù)后48 h與72 h時(shí)間點(diǎn)，L161982預(yù)處理細(xì)胞中各劑量組的抑制率均最高，基于上述預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第48 h時(shí)間點(diǎn)作為檢測(cè)觀察點(diǎn)。此外，在不同劑量組同一時(shí)間點(diǎn)的比較中，EP4抑制劑L161982各劑量組均能抑制人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖，且抑制率隨著抑制劑濃度增大而升高，其中以L3組增殖抑制率最高。以上結(jié)果可表明抑制EP4后可明顯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，且抑制增殖的作用存在較明顯的時(shí)間、劑量相關(guān)性。為了進(jìn)一步探討上述抑制增殖作用是否通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡而實(shí)現(xiàn)，我們使用流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot進(jìn)行檢測(cè)，后發(fā)現(xiàn)這種損傷作用以細(xì)胞凋亡為主，凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)增高，Annexin V/PI檢測(cè)結(jié)果與Western Blot法檢測(cè)結(jié)果一致，Caspase-3蛋白的表達(dá)在EP4抑制劑各劑量組均明顯升高，且存在一定的量效相關(guān)性，在對(duì)照組僅有少量表達(dá)，該結(jié)果提示抑制EP4而抑制HT29細(xì)胞增殖可能是通過(guò)Caspase-3來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

本實(shí)驗(yàn)初步表明抑制EP4能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡，且存在著一定的劑量相關(guān)性。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞和分子水平證實(shí)了PGE2的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用可能是通過(guò)受體EP4這一途徑實(shí)現(xiàn)。

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(編輯：吳小紅)

Effect of EP4 on HT29 Cell Proliferation

GAOYan，JIANGHao，SUNZhiguo，etal.

HongQiHospitalofMudanjiangMedicalSchool,Mudanjiang,157011

Objective To observe the effect of prostaglandin E2 receptor4 on HT29 proliferation.Methods HT29 cells were pretreated with L161982,antagonist of EP4.MTT was added to measure the cell viability.HT29 apoptosis was measured by Flow Cytometry.Protein expression of Caspase-3 was examined by Western Blot.Results The survival rate of HT29 cells that were pretreated with L161982 was significantly lower than those without pretreatment (P<0.05).The expression levels of Caspase-3 and cell apoptosis increased significantly after pretreatment.Conclusion EP4 is involved in the pathogenesis of HT29 cells proliferation and apoptosis induced by L161982,and this may be molecular mechanism of proliferation of colon cancer cells.

Prostaglandin E2；Prostaglandin EP4；HT29

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2011-308)

157011黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院(高 巖，姜 浩，孫治國(guó))；157000 中國(guó)人民解放軍93383部隊(duì)醫(yī)院(高 健)

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.002

R735.3+7

A

1001-5930(2014)12-1518-04

2014-07-08

2014-09-14)