趙 越 韓東洺 尹紹鵬 孫鳳陽 胡 穎 盧 宏 由香玲

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

三七(Panax notoginseng(Burk.)FH.Chen)為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，含有皂苷類物質(zhì)、黃酮、多糖類等多種活性成分。其中人參皂苷類抗氧化活性的特點已被應用到緩解衰老以及衰老性疾病防治方面的食品和化妝品等領域，因為活性氧自由基可直接或間接損傷DNA，導致DNA鏈斷裂和染色體斷裂，誘導很多疾病的發(fā)生［1－3］。很多研究顯示，三七多糖也具有增強免疫的功能［4－6］。

近年來，應用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)有用次級代謝產(chǎn)物日益引人注目，紫草細胞、人參細胞、紅豆杉細胞等已實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)［7］。三七由于自然生長及栽培地區(qū)非常狹窄，產(chǎn)量很有限。利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)對其進行規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)有效成分，具有非常重要的經(jīng)濟價值。三七細胞培養(yǎng)處于實驗室研究階段，Zhong等初步研究了高密度培養(yǎng)細胞生產(chǎn)人參皂苷及三七多糖的技術(shù)［8－9］，但是有關培養(yǎng)材料中三七皂苷類物質(zhì)清除自由基活性方面及多糖的累積量如何，目前未查到相關報道。筆者在研究體細胞胚發(fā)生的基礎上，考查不同發(fā)育時期體細胞胚中三七皂苷清除DPPH自由基活性及多糖累積量，進一步大規(guī)模培養(yǎng)篩選合適的外植體及培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 三七不同發(fā)育時期體細胞胚的獲得

在前期試驗中已成功建立了三七體胚發(fā)生再生體系［10］，并且獲得了大量的胚性愈傷組織(見圖1a)。將胚性愈傷移入體細胞胚發(fā)生培養(yǎng)基上誘導體胚發(fā)生，4周后愈傷組織上生長出大量前期體胚(球形胚和心形胚，見圖1b);然后進行繼代，體細胞胚繼續(xù)萌發(fā)，4周后大部分發(fā)育到后期體細胞胚(魚雷胚和子葉體胚，見圖1c);子葉胚繼續(xù)萌發(fā)生長8周后，該胚苗根部隆起變粗(見圖1d)。收集上述各時期的樣品于烘箱中60℃烘干，對其多糖質(zhì)量分數(shù)及抗氧化活性進行分析。

為了能更清楚地說明不同發(fā)育時期體細胞胚中的多糖質(zhì)量分數(shù)及抗氧化活性狀況，同時分析了栽培3 a的三七根中多糖質(zhì)量分數(shù)。

1.2 不同發(fā)育時期三七體細胞胚中的多糖質(zhì)量分數(shù)測定

收集的材料中多糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用蒽酮比色法進行。糖類遇濃硫酸發(fā)生脫水，形成糠醛及其衍生物，該衍生物可與蒽酮發(fā)生反應，呈藍綠色。該方法快速簡便，具體步驟參考姜曼花的方法［11］。

1.2.1 樣品中多糖的提取

三七的胚性愈傷組織、前期體胚、后期體胚、體胚苗以及栽培根粉末各1.0 g，置于10 mL離心管中，分別加入4 mL蒸餾水，在100℃水浴中提取4 h，7 000 r/mim離心10 min，收集上清液。在上清液中緩慢加入體積為上清液3倍的95%乙醇，邊加邊攪動，于4℃條件下靜置12～24 h后取出，9 000 r/mim離心10 min，將上清液棄去，收集沉淀，乙醇揮干后即為所提多糖。提取所得的多糖加10 mL蒸餾水溶解，即得供試樣品溶液。

1.2.2 最大吸收波長的確定

以葡萄糖為標準品，配置質(zhì)量濃度為200 mg/L的葡萄糖母液。取2個10 mL離心管，一個不加母液，加入蒸餾水1.0 mL;另一個加入母液、蒸餾水各0.5 mL。2試管中再分別加入8.0 mL蒽酮試劑，搖勻。沸水浴中加熱10 min后取出迅速放在冰水中冷卻至室溫，搖勻。在500～700 nm波長范圍內(nèi)掃描(以空白管作對照)，確定最大吸收波長為630 nm。

1.2.3 標準曲線的繪制

以葡萄糖溶液為標準品繪制標準曲線，得到回歸方程為:y=0.030 0+0.005 0x，相關系數(shù) r=0.996 2，線性范圍為 0～0.2 mg。

1.2.4 樣品中多糖質(zhì)量分數(shù)測定

吸取各樣品供試溶液1.0 mL于10 mL離心管中，按標準曲線制備的方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中多糖質(zhì)量分數(shù)。平行操作3次，結(jié)果取平均值。

1.3 不同發(fā)育時期三七體細胞胚中的抗氧化活性分析

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示，清除率越大，抗氧化活性就越強，該方法被廣泛應用于清除自由基物質(zhì)活性研究。DPPH自由基含有單電子，在517 nm波長處有一強吸收，其乙醇溶液呈深紫色。

1.3.1 樣品溶液的制備

精密稱取(60±1)℃干燥至恒質(zhì)量的實驗室組織培養(yǎng)的三七胚性愈傷組織、前期體胚、后期體胚、體胚苗以及栽培三七根粉末各0.5 g，以5 mL 75%乙醇浸泡過夜，次日以75%乙醇室溫超聲提取3次，5 mL/次，每次提取 30 min，合并提取液，以 0.45 μm 微孔濾膜濾過，75%乙醇定容至25.0 mL。80℃水浴減壓蒸干溶劑后，以75%乙醇復溶，并定容至8.0 mL。栽培三七根提取物定容至 2.0 mL，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試樣品溶液。

1.3.2 標準對照品

以維生素C(Vc)為標準對照品。精密稱取0.001 0 g Vc粉末，以75%乙醇溶解并且定容至10 mL，配成質(zhì)量濃度為0.1 g/L的Vc溶液，作為標準對照液。

1.3.3 皂苷粗提物對DPPH自由基的清除測定

抗氧化活性的分析用文獻［12］的方法。

清除率=((Ab－Aa)/Ab)×100%。

式中:Aa為待測樣品，即100 μL Vc或樣品供試液與1 mL DPPH自由基溶液和1.4 mL 75%乙醇溶液混合的吸光度;Ab為空白對照，即1 mL DPPH自由基溶液和1.4 mL 75%乙醇溶液混合的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用 Excel、SPSS(version 17.0)軟件處理數(shù)據(jù)，運用ANOVA分析法中的鄧肯多重比較法(P＜0.05)對同一批取樣后的數(shù)據(jù)進行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七體細胞胚發(fā)生

按照已建立的三七體細胞胚發(fā)生及其植株再生體系，獲得的實驗材料見圖1。

2.2 不同發(fā)育時期三七體細胞胚中的多糖質(zhì)量分數(shù)

測定不同發(fā)育時期三七體胚中多糖質(zhì)量分數(shù)，并對其進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。不同發(fā)育時期的體胚中多糖質(zhì)量分數(shù)差異顯著，從大到小依次為后期體胚、前期體胚、體胚苗、胚性愈傷組織;最高的是后期體胚，為16.44 mg/g;最低的為胚性愈傷組織，為12.24 mg/g。該實驗也對栽培3 a三七根中的多糖質(zhì)量分數(shù)進行了分析，結(jié)果為58.74 mg/g。后期體胚中多糖的質(zhì)量分數(shù)占總栽培的27.99%，其培養(yǎng)時間較短，說明后期體細胞胚中多糖的含量相當可觀。

表1 三七不同發(fā)育時期體胚中多糖質(zhì)量分數(shù)

圖1 不同發(fā)育時期的體細胞胚及栽培三七根

2.3 不同發(fā)育時期三七體細胞胚皂苷粗提物對DPPH自由基的清除作用

不同發(fā)育時期三七體細胞胚中的皂苷粗提物對DPPH自由基清除作用、數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計見圖2?？梢钥闯?Vc和各時期體細胞胚中的皂苷對DPPH自由基的清除作用趨勢一致，都是在一定范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增大清除能力增加，達到一定的質(zhì)量濃度后，清除作用趨于平穩(wěn)。但Vc清除自由基的速率更快，而三七體胚材料皂苷粗提物的清除速率很慢，在較長時間內(nèi)清除作用才能達到平穩(wěn)。王晶等認為:此特性在聯(lián)合用藥中有利于人參皂苷抗自由基作用的緩慢釋放［13］。

常用清除率為50%對應的樣品質(zhì)量濃度，即稱為此樣品的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)，用來表示樣品清除DPPH自由基的能力大小。IC50值越低，表明其抗氧化、清除自由基的能力越強。將上述Vc和各不同三七材料粗提物對DPPH自由基清除作用用IC50方法進行統(tǒng)計分析(見表2)?？梢?，與Vc相比，栽培三七皂苷粗提物和培養(yǎng)的各不同發(fā)育時期材料皂苷粗提物對自由基的清除能力都較弱。這與許多研究人參、西洋參、三七皂苷對DPPH自由基清除作用的結(jié)論相同:人參皂苷對DPPH自由基具有一定的清除能力，是一種較弱的自由基清除劑［1－2，13］。

圖2 Vc及三七不同發(fā)育時期體胚對DPPH自由基的清除作用

表2 三七不同發(fā)育時期體胚及栽培三七根皂苷粗提物與Vc的IC50

不同發(fā)育時期體細胞胚皂苷粗提物對DPPH自由基的清除作用有較顯著差異，從強到弱順序為:胚性愈傷組織、體胚苗、栽培三七根、前期體胚、后期體胚。胚性愈傷組織皂苷粗提物的清除能力最強，IC50值為3.670 g·L－1;最弱的為后期體胚皂苷粗提物，IC50值達 8.116 g·L－1。栽培三七皂苷粗提物對DPPH自由基的清除作用與體細胞胚苗的接近，低于胚性愈傷組織皂苷粗提物。因此，三七體胚的培養(yǎng)材料在抗氧化活性方面要優(yōu)于栽培三七。

3 結(jié)論與討論

不同發(fā)育時期的體胚中多糖質(zhì)量分數(shù)的差異可能與胚性細胞的生長和發(fā)育相關，胚性細胞在后期體胚階段生長更旺盛，需要大量糖類來維持旺盛的代謝;而到體細胞胚苗階段，生長較緩慢，糖類合成降低;也可能與培養(yǎng)條件有關。本研究獲得了多糖質(zhì)量分數(shù)最高的后期體細胞胚材料，需進一步對其生長速率進行研究，以期短時間內(nèi)獲得更多三七多糖。

不同發(fā)育時期體胚的皂苷粗提物對DPPH自由基的清除作用與栽培三七根的相似，都較Vc弱且作用緩慢，有利于皂苷藥效的緩釋作用。三七不同發(fā)育時期體細胞材料中，胚性愈傷組織皂苷的粗提物對DPPH自由基的清除作用最強，強于栽培三七根皂苷粗提物的作用。而在前期的研究中，三七不同發(fā)育時期體細胞材料胚性愈傷組織中皂苷的質(zhì)量分數(shù)最低。可能的原因是，本研究所用的皂苷粗提物采用五加科植物皂苷提取的方法，用75%乙醇為溶劑，該粗提物中可能同時含有很多其他活性物質(zhì)，如黃酮類、酚類等，它們對自由基的清除作用相比皂苷類要強很多，因此，出現(xiàn)皂苷質(zhì)量分數(shù)與自由基清除作用不一致的結(jié)果。4～6年生刺老芽根提取物對DPPH自由基清除能力的研究也顯示，4 a的清除能力高于6 a的，而與皂苷的累積量不一致［14］。丁克祥等認為:一般植物提取物中的抗氧化物有黃酮類、酚類、皂苷類、多糖類等，其含量和組成決定了抗氧化性的大小［15］。幼嫩組織清除自由基的能力一般高于老的部分，例如黃素梅等在研究幾種香蕉廢棄物清除DPPH自由基過程中發(fā)現(xiàn):各種材料清除DPPH自由基的能力最強的是最幼嫩部分，即嫩苞片［16］。

綜上所述，與大田栽培3 a的三七根相比，三七體胚培養(yǎng)材料中的多糖質(zhì)量分數(shù)在生長時間上很可觀。體胚培養(yǎng)材料與大田栽培3 a的三七根皂苷粗提物在抗氧化活性——清除DPPH自由基方面，有相似的緩慢特性，且前者材料中胚性愈傷組織對DPPH自由基的清除作用要優(yōu)于后者。因此，三七體胚培養(yǎng)材料是進行規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)有效成分的很好材料。

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