范東偉 陳仲?gòu)?qiáng) 郭昭慶 齊 強(qiáng) 李危石

臨床研究

周期性牽張應(yīng)力對(duì)人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞合成和分解的影響*

范東偉 陳仲?gòu)?qiáng)△郭昭慶 齊 強(qiáng) 李危石

目的探討不同牽張應(yīng)力對(duì)體外培養(yǎng)的人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞合成和分解代謝的影響。方法采用Flexercell Strain Unit對(duì)人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞施加不同拉伸幅度的周期性牽張應(yīng)力，通過(guò)Real-time PCR，蛋白印跡法，免疫組化以及阻斷劑等方法，檢測(cè)細(xì)胞合成代謝基因（collagen-1A1，collagen-2A1，aggrecan，versican）和分解代謝基因（MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4，ADAMTS-5）在周期性牽張應(yīng)力下椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果合成代謝基因中collagen-1A1和collagen-2A1在12%的應(yīng)力條件下較對(duì)照組表達(dá)升高，collagen-2A1在18%表達(dá)下降，分解代謝基因MMP-13和ADAMTS-5在12%和18%的應(yīng)變下較對(duì)照組表達(dá)升高，ADAMTS-4表達(dá)隨應(yīng)力拉伸幅度升高而表達(dá)增強(qiáng)。ERK1/2的阻斷劑U0126，能明顯阻斷應(yīng)力誘導(dǎo)的ADAMTS-4的表達(dá)，而p38和JNK的阻斷劑SP6000125和SB203580阻斷應(yīng)力誘導(dǎo)ADAMTS-4表達(dá)作用不明顯。結(jié)論不同拉伸幅度的牽張應(yīng)力對(duì)椎間盤纖維化細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響不同，其結(jié)果可以影響椎間盤的退變。

骨折，應(yīng)力性；椎間盤；信號(hào)傳導(dǎo)；椎間盤細(xì)胞；ADAMTS-4；ERK

應(yīng)力是導(dǎo)致椎間盤退變的重要原因之一[1]。應(yīng)力作用于椎間盤細(xì)胞，影響椎間盤細(xì)胞代謝，從而影響椎間盤功能。椎間盤通過(guò)分解代謝基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、解整鏈蛋白金屬蛋白酶（ADAMTS）-4、ADAMTS-5和合成代謝基因，如聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Ⅰ型膠原（collagen-1A1）、Ⅱ型膠原（collagen-2A1）、硫酸軟骨素蛋白聚糖（versican），來(lái)調(diào)節(jié)椎間盤的分解與合成代謝，維持椎間盤的穩(wěn)態(tài)[2]。然而，應(yīng)力調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的機(jī)制目前還不十分清楚。本研究應(yīng)用Flexercell細(xì)胞應(yīng)變加載裝置對(duì)體外培養(yǎng)的人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞施加確定頻率、不同幅度和時(shí)間的周期性張力應(yīng)變，觀察人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的合成與分解代謝基因的表達(dá)變化以及MAPK信號(hào)通路的調(diào)控影響，為進(jìn)一步了解機(jī)械力對(duì)椎間盤細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制提供資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞牽張裝置及其他主要設(shè)備和試劑 Equi-Biaxial牽張裝置及原理見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。Olympus倒置相差顯微鏡，Theroma CO2孵箱，胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)。

1.2 標(biāo)本取材、細(xì)胞分離與培養(yǎng) 標(biāo)本取材經(jīng)過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取自5例臨床脊柱創(chuàng)傷患者，女3例，男2例，平均年齡43歲。術(shù)中取椎間盤纖維環(huán)組織，做細(xì)胞培養(yǎng)。將剪成小塊的纖維環(huán)組織均勻貼附于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使貼壁的組織塊懸空，靜置8 h后，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，加入少量培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM)內(nèi)，12 h后再次加入培養(yǎng)基完全覆蓋組織塊，置37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)；待組織塊周圍有大量細(xì)胞遷出后，去除脫落的組織塊，3～5 d更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底80%時(shí)，用PBS液清洗2次，用原裝Hyclone胰酶消化液(含0.25%胰酶，0.02%EDTA)37℃消化細(xì)胞2～4 min；以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，以1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。同法，將細(xì)胞懸液800 r/min離心5 min，棄去上清，細(xì)胞沉淀在含90%胎牛血清、10%DMSO的溶液內(nèi)凍存，-80℃3 d后，轉(zhuǎn)至液氮保存。

1.3 細(xì)胞周期性張應(yīng)變加載 計(jì)數(shù)消化好的細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種于6孔Bio-Flex培養(yǎng)板(Flexcell International，USA)底的硅膠膜上；每孔加2 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，次日換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用Flexcell細(xì)胞應(yīng)變加載系統(tǒng)(Flexercell FX-4000T strain unit，F(xiàn)lexcell International，USA)對(duì)細(xì)胞施加周期性張應(yīng)變。該系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)控制臺(tái)、真空泵和置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)的加載基臺(tái)組成，將接種細(xì)胞后的6孔Bio-Flex培養(yǎng)板置于基臺(tái)并密封，由真空泵以一定的頻率抽吸真空引起培養(yǎng)板的硅膠膜變形，由此引起黏附于硅膠膜上的細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的變形，即對(duì)細(xì)胞加載了相應(yīng)的周期性張應(yīng)變。周期性張力應(yīng)變的頻率、牽張幅度和加載時(shí)間均由計(jì)算機(jī)控制。加載方案：幅度分別為6%(6%組)，12%(12%組)和18%(18%組)，時(shí)間均為24 h，頻率均為0.2 Hz，以未加載的靜態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.4 Real-time PCR檢測(cè) 牽張應(yīng)力作用24 h后收細(xì)胞。應(yīng)用Trizol(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取細(xì)胞總RNA。使用Superscript first-strand synthesis system反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第1條鏈。ABI SYBR Real-time PCR試劑盒。反應(yīng)條件：95℃5 min，然后95℃15 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。所有操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。表達(dá)引物見(jiàn)表1。β-actin引物同F(xiàn)an等[4]的設(shè)計(jì)，北京奧科公司合成。檢測(cè)基因均屬于椎間盤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的基因。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 用2倍蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ADAMTS-4的表達(dá)量，用β-actin作為內(nèi)參。按比例稀釋一抗：anti-ADAMTS-4抗體，1∶300(Santa Cruz，USA)；β-actin 抗體，1∶1 000(Santa Cruz Technologies，USA)；圖像掃描后，用Alpha Imager 2200(Alpha Innotech)軟件進(jìn)行圖像灰度分析。

1.6 信號(hào)通路的研究 為了明確是ERK1/2、p38還是JNK信號(hào)通路在張力應(yīng)變過(guò)程中發(fā)揮作用，采用ERK1/2信號(hào)通路

Table 1 PCR primers used to detect gene expression表1 用于檢測(cè)基因表達(dá)的引物序列

2 結(jié)果

2.1 牽張應(yīng)力對(duì)椎間盤細(xì)胞基因表達(dá)的影響 和對(duì)照組相比，12%組、18%組aggrecan基因表達(dá)減少，collagen-1A1和collagen-2A1在12%組較對(duì)照組略有升高，collagen-2A1在18%組較對(duì)照組表達(dá)降低。versican表達(dá)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6%組、12%組、18%組ADAMTS-4基因隨著牽張應(yīng)力的增加而表達(dá)增加，而MMP-13和ADAMTS-5在12%和18%組較對(duì)照組升高，6%組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-3表達(dá)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

2.2 各信號(hào)通路ADAMTS-4基因表達(dá)情況 Realtime PCR結(jié)果顯示，ERK1/2信號(hào)通路的阻斷劑U0126可以顯著阻斷牽張應(yīng)力誘導(dǎo)的ADAMTS-4 mRNA表達(dá)升高，而p38信號(hào)通路的阻斷劑SB203580，以及JNK信號(hào)通路的阻斷劑SP600125，盡管可以誘導(dǎo)ADAMTS-4表達(dá)的降低，但是與牽張應(yīng)力組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，在蛋白表達(dá)水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果，見(jiàn)圖2。

Figure 1 The relative mRNA expression profiling of anabolic genes and catabolic genes under different magnitudes of mechanical stretch圖1 合成代謝基因和分解代謝基因在不同牽張應(yīng)力下的mRNA水平上的表達(dá)情況

Figure 2 Effects of MAPK inhibitor on the mRNA(A)and protein expression(B)profiling of ADAMTS-4圖2 采用MAPK阻斷劑后觀察ADAMTS-4分別在mRNA（A）和蛋白水平（B）的表達(dá)（＊P＜0.05）

3 討論

在應(yīng)力的作用下，椎間盤細(xì)胞的代謝將影響椎間盤基質(zhì)的降解與合成，從而導(dǎo)致椎間盤重建。在這一過(guò)程中合成代謝基因與分解代謝基因發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，周期性張應(yīng)變可以引起椎間盤細(xì)胞的椎間盤基質(zhì)代謝基因表達(dá)的改變，而且不同牽張幅度的應(yīng)力，導(dǎo)致椎間盤基質(zhì)基因表達(dá)不同，在低牽張應(yīng)力下，合成代謝基因表達(dá)升高，分解代謝基因表達(dá)降低；在高牽張應(yīng)力下，分解代謝基因表達(dá)升高，合成代謝基因表達(dá)降低。這些結(jié)果提示，椎間盤組織在遭受周期性高應(yīng)力環(huán)境下，可能會(huì)引起椎間盤基質(zhì)分解增加，合成減少，從而導(dǎo)致退變的發(fā)生[5]。

ADAMTS-4是一種含有Zn離子的聚集蛋白聚糖水解酶，它帶有血小板凝集酶敏感蛋白樣模體，能夠降解細(xì)胞基質(zhì)中多聚蛋白聚糖及Ⅱ型膠原，導(dǎo)致退變的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在18%的應(yīng)變下，椎間盤細(xì)胞分解代謝基因中ADAMTS-4表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-4表達(dá)隨應(yīng)力拉伸幅度升高而表達(dá)增強(qiáng)[6]。

MAPKs蛋白激酶家族可以接受細(xì)胞外力學(xué)信號(hào)，將胞外刺激信號(hào)傳遞給胞核，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等，該家族包括ERK、JNK和p38等亞族[7]。筆者進(jìn)一步對(duì)應(yīng)力調(diào)節(jié)ADAMTS-4表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的阻斷劑U0126，能明顯阻斷應(yīng)力誘導(dǎo)的ADAMTS-4的表達(dá)，而p38和JNK的阻斷劑SP6000125和SB203580阻斷應(yīng)力誘導(dǎo)ADAMTS-4表達(dá)作用不明顯。提示，應(yīng)力主要通過(guò)ERK1/2來(lái)調(diào)節(jié)ADAMTS-4的表達(dá)，進(jìn)而影響椎間盤細(xì)胞的分解代謝。

本研究表明，不同拉伸幅度的牽張應(yīng)力對(duì)椎間盤纖維化細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響不同，其結(jié)果可以影響椎間盤的退變。在這一過(guò)程中，周期性張應(yīng)力可以通過(guò)ERK1/2-ADAMTS-4信號(hào)通路調(diào)控了椎間盤細(xì)胞的分解代謝。以上結(jié)果進(jìn)一步豐富了應(yīng)力對(duì)椎間盤細(xì)胞影響的研究，對(duì)探討應(yīng)力導(dǎo)致椎間盤退變機(jī)制具有重要的參考意義。

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（2013-12-23收稿 2014-01-08修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of Different Magnitudes of Mechanical Stretch on Human Intervertebral Disc Cells

FAN Dongwei,CHEN Zhongqiang△,GUO Zhaoqing,QI Qiang,LI Weishi
Department of Orthopaedics,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

ObjectiveTo investigate the effects of different magnitudes of mechanical stress on human intervertebral disc degeneration.MethodsThe human intervertebral disc cells were subjected to different magnitudes of mechanical stress(0,6%,12%,or 18%elongation)for 24 h using a Flexercell Strain Unit.The mRNA expressions of anabolic genes(collagen-1A1,collagen-2A1,aggrecan and versican)and catabolic genes(MMP-3,MMP-13,ADAMTS-4 and ADAMTS-5)were examined by real-time PCR and Western blot methods.ResultsThe expression levels of collagen-1A1 and collagen-2A1 were increased at 12%of mechanical stress,and collagen-2A1 was decreased at 18%of mechanical stress compared with those of control.The mRNA expressions of catabolic genes,MMP-13 and ADAMTS-5,were increased at 12%and 18%of mechanical stress than those of control.The mechanical stretch induced a magnitude-dependent increase in ADAMTS-4 synthesis,which was finely tuned by stretching-triggered activation of distinct mitogen-activated protein kinase cascades.Specifically,an ERK1/2 specific inhibitor,U0126,significantly inhibited the stretching-induced ADAMTS-4 expression,whereas the inhibitors of p38 and JNK,SP6000125 and SB203580,showed only slightly effect on the stretching-induced ADAMTS-4 expression.ConclusionThe different magnitudes of mechanical stretch exhibited different effects on the biological behavior of intervertebral disc cells,which profoundly affects the intervertebral disc degeneration.

fractures,stress;intervertebral disk;signal transduction;intervertebral disc cells；ADAMTS-4；ERK

R34 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.015

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30801156、81071505）

北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科（郵編100191）

△通訊作者 E-mail：chenzq@bjmu.edu.cn