曹國龍 劉小坡 馮云波 田發(fā)明

洛伐他汀聯(lián)合降鈣素治療骨質(zhì)疏松大鼠骨折的效果分析

曹國龍1劉小坡1馮云波1田發(fā)明2△

目的探討洛伐他汀單獨(dú)或聯(lián)合降鈣素對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨折愈合的影響。方法4月齡雌性SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常骨折（A）組、骨質(zhì)疏松性骨折（B）組、洛伐他汀治療（C）組、降鈣素治療（D）組和聯(lián)合治療（E）組，每組8只。A組行假手術(shù)，B、C、D、E組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，術(shù)后8周制作股骨干骨折模型，骨折后8周處死大鼠。采用ELISA法檢測血Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP），X線攝片及評(píng)分觀察骨折愈合情況，骨密度檢測骨折側(cè)股骨骨密度，生物力學(xué)分析骨折側(cè)股骨最大載荷。結(jié)果（1）血清PINP水平：A組顯著低于其余各組，C、E組顯著高于B組，D組顯著低于C組。（2）X線示A、E組愈合良好，B組多數(shù)標(biāo)本可見模糊骨折線，C、D組略好于B組。評(píng)分結(jié)果：A、E組顯著高于B、C、D組。（3）骨密度：股骨全長及中段骨密度A組最高，E、D、C組次之，B組最小。（4）最大載荷：A組大鼠骨折側(cè)股骨最大載荷顯著高于其余4組，E組顯著高于B組。結(jié)論骨質(zhì)疏松大鼠骨量下降、骨折愈合進(jìn)程延遲，洛伐他汀聯(lián)合降鈣素較單獨(dú)應(yīng)用可更有效地抑制骨質(zhì)疏松大鼠骨量的丟失并促進(jìn)骨折的愈合。

骨質(zhì)疏松；骨折；洛伐他??；降鈣素；骨密度；疾病模型,動(dòng)物

隨著人口老齡化的逐步加劇，骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折已成為威脅中老年人群健康的主要社會(huì)公共健康問題之一。目前臨床廣泛應(yīng)用的包括降鈣素在內(nèi)的骨質(zhì)疏松治療藥物多為骨吸收抑制劑，對(duì)骨折愈合的作用尚存爭議[1]。1999年Mundy等[2]首次發(fā)現(xiàn)洛伐他汀具有成骨作用潛能，此后諸多學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了深入研究，并進(jìn)一步證實(shí)了洛伐他汀的成骨作用[3-4]，但對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的治療效果鮮見報(bào)道，且有研究顯示他汀類藥物單獨(dú)系統(tǒng)性給藥的成骨作用有限[5]。本研究擬通過建立骨質(zhì)疏松性骨折模型，同時(shí)給予洛伐他汀和降鈣素單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用，綜合分析洛伐他汀聯(lián)合降鈣素應(yīng)用對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨代謝、骨折愈合的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4月齡雌性SD大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（270±25）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心[動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2009-0004號(hào)]。

1.2 主要試劑和儀器 洛伐他?。↙ovastatin，商品名：美降之，浙江瑞邦藥業(yè)有限公司），鮭魚降鈣素（商品名：密蓋息，瑞士諾華公司），ELISA試劑盒（上海史瑞可生物科技有限公司），Norland-XR 36雙能X線骨密度測量儀（美國DEXA公司），X線攝像儀（美國通用公司）。

1.3 動(dòng)物分組及處理 所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組：正常骨折（A）組、骨質(zhì)疏松性骨折（B）組、洛伐他汀治療（C）組、降鈣素治療（D）組和洛伐他汀與降鈣素聯(lián)合治療（E）組，每組8只。A組行假手術(shù)。B、C、D、E組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)：采用1%戊巴比妥鈉以40 mg/kg腹腔注射麻醉，背側(cè)入路，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm處取縱行切口，長約1 cm，暴露腹腔卵巢并予以切除后，以絲線將殘端結(jié)扎，逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后8周所有大鼠制作股骨干骨折模型。A組不予干預(yù)；B組按2 mL/kg給予生理鹽水灌胃；C組給予洛伐他汀20 mg/kg溶于生理鹽水（40 g/L）中灌胃；D組給予降鈣素10 IU/kg，皮下注射；E組給予洛伐他汀和降鈣素（按C、D組劑量）聯(lián)合干預(yù)，均每天1次。骨折后8周處死大鼠。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP）水平的測定 所有大鼠處死前留取24 h尿液，再分別抽取外周血2 mL，采用ELISA法檢測血PINP值。

1.4.2 計(jì)算機(jī)X線攝像儀（CR）攝片 將大鼠完整的右側(cè)股骨干骨折標(biāo)本經(jīng)CR攝片（距離90 cm，電壓40 kV、電流3.2 mA），觀察大鼠股骨骨折骨痂的連續(xù)性及骨折愈合情況[2]。CR攝片評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，骨折線清晰可見，無明顯骨膜反應(yīng)；1分，骨折斷端邊緣趨向模糊，骨膜輕度反應(yīng)，無骨痂可見；2分，斷端邊緣模糊，骨膜反應(yīng)淺淡，骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊；3分，斷端邊緣仍可見，但接近消失，骨膜反應(yīng)較深，骨痂量增多，但尚未填滿缺損，密度增深，邊緣較清；4分，斷端邊緣完全消失，骨膜反應(yīng)密度近似骨影，骨痂填滿缺損，與骨皮質(zhì)密度相同并相互連接。每張片均由3名骨科醫(yī)生分別評(píng)分，取平均值。如評(píng)分醫(yī)師認(rèn)為愈合情況介于兩種分級(jí)之間，可以0.1分為打分單位。

1.4.3 骨密度的測量 應(yīng)用Norland-XR36 DEXA，采用小物體掃描模式，準(zhǔn)確度0.01%，掃描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描寬度5.0 cm，進(jìn)行右側(cè)股骨骨密度的測量。測量時(shí)，將固定骨折部位的克氏針拔除，依據(jù)骨密度測量儀實(shí)際掃描測量的股骨長度，分別測量整體骨密度（tBMD）和中段（中1/2）骨密度（mBMD）。

1.4.4 三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn) 取所有大鼠的右側(cè)股骨行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，支點(diǎn)跨距（L）為20 mm，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率10 mm/min，在軟件里直接得到最大載荷（FM）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，利用單因素方差分析比較各組均數(shù)間的差異，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果 B、C、D、E組血清PINP高于A組，C、E組顯著高于B組，D組低于C組，E組高于D組，其余組間PINP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各組大鼠PINP、BMD、FM及X線評(píng)分結(jié)果（n=8±s）

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各組大鼠PINP、BMD、FM及X線評(píng)分結(jié)果（n=8±s）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組E組F PINP（mg/L）0.142±0.039 0.286±0.057a0.304±0.043ab0.281±0.040ac0.325±0.045abcd1 486.462＊＊tBMD（g/cm2）0.218±0.015 0.161±0.017a0.175±0.012ab0.181±0.011abc0.190±0.016abcd1 314.078＊＊組別A組B組C組D組E組F mBMD（g/cm2）0.206±0.014 0.150±0.012a0.171±0.010ab0.174±0.020abc0.183±0.015acbd1 177.430＊＊FM（N）78.62±12.37 38.60±9.46a49.10±16.71a49.60±12.58a57.50±13.92ab7.654＊＊X線評(píng)分4.95±0.67 2.63±0.39a3.19±0.36a3.13±0.35a4.08±0.45abcd19.612＊＊

2.2 骨密度檢測結(jié)果 不同組間股骨tBMD及mBMD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為A組最高，E、D、C組次之，B組最低，見表1。

2.3 生物力學(xué)檢測結(jié)果 A組大鼠骨折側(cè)股骨FM高于其余4組，E組高于B組，其余組間FM差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.4 X線檢查結(jié)果 A組大鼠骨折愈合較好，多數(shù)標(biāo)本骨折線消失；B組愈合顯著延遲，骨折線仍可見，骨痂密度較淡，仍明顯低于正常骨組織；C、D組略好于B組；E組較B組改善明顯，個(gè)別標(biāo)本愈合情況良好，斷端邊緣模糊，甚至接近消失，見圖1。X線評(píng)分結(jié)果顯示A、E組高于B、C、D組，且A組高于E組，其余組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

3 討論

3.1 骨質(zhì)疏松對(duì)骨折愈合的影響 骨質(zhì)疏松對(duì)骨折愈合的不利影響已屢有報(bào)道[6-7]。骨折愈合進(jìn)程大致分為血腫機(jī)化演進(jìn)期、原始骨痂形成期、骨痂塑形改造期，即一般所說的早、中、晚期。本研究選擇6月齡大鼠骨折后8周為觀測時(shí)間點(diǎn)，正常大鼠大致處于骨痂塑形或更成熟階段，但影像學(xué)分析和生物力學(xué)檢測結(jié)果均提示骨質(zhì)疏松大鼠骨痂仍未成熟，也再次證實(shí)了在去卵巢建立的大鼠骨質(zhì)疏松骨折模型中，不僅骨密度顯著降低，骨折愈合進(jìn)程較正常大鼠明顯延遲。

Figure 1 Results of X-ray film in five groups of model rats圖1 各組模型X線檢測結(jié)果

3.2 聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥效果比較 諸多研究證實(shí)部分他汀類藥物包括辛伐他汀和洛伐他汀具有成骨作用潛能，尤以體外研究為著[3,8]。體內(nèi)研究中對(duì)他汀類藥物的成骨作用尚未達(dá)成一致結(jié)論，局部用藥尤其是復(fù)合他汀類藥物的生物緩釋材料成骨效果顯著[9]，但系統(tǒng)性給藥到達(dá)骨組織的藥物濃度過低，成骨效果受限[5]。然而系統(tǒng)給藥具有對(duì)骨折局部干預(yù)少、實(shí)施方便易行等優(yōu)點(diǎn)。聯(lián)合用藥為解決這一問題提供了新的思路[10]，因此本研究采用洛伐他汀與骨吸收抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，探討藥物在抑制骨吸收的基礎(chǔ)上充分發(fā)揮其促骨形成的作用。降鈣素作為臨床治療骨質(zhì)疏松的一線藥物，其對(duì)骨折愈合的不良反應(yīng)尚鮮見報(bào)道，因此本研究選擇降鈣素作為聯(lián)合藥物。結(jié)果證實(shí)，雖然單獨(dú)用藥組對(duì)骨密度的維持及骨折愈合均有一定的積極作用，但效果不及聯(lián)合用藥明顯，洛伐他汀與降鈣素聯(lián)合用藥不僅更大限度地維持了骨質(zhì)疏松大鼠的骨量，還在此基礎(chǔ)上促進(jìn)了骨質(zhì)疏松大鼠骨折的愈合，改善其力學(xué)性能。

3.3 生化指標(biāo)檢測結(jié)果及分析 外周血中特異性生化標(biāo)志物的檢測有助于分析藥物干預(yù)后大鼠骨代謝狀態(tài)的改變，作為反映骨形成活躍程度的血清骨代謝指標(biāo)PINP檢測結(jié)果顯示，正常大鼠骨形成狀態(tài)反而更低，其原因可能為：模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的骨轉(zhuǎn)換水平明顯增高，即骨吸收與骨形成活性同時(shí)增加，而對(duì)于不存在高骨吸收活性的正常大鼠，其正常骨形成能力足以保證骨折的順利愈合。洛伐他汀單獨(dú)或聯(lián)合降鈣素應(yīng)用后PINP的血清學(xué)水平均顯著高于B組，可能與洛伐他汀刺激骨形成的作用有關(guān)，具體原因尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（2013-06-17收稿 2013-10-08修回）

（本文編輯 李鵬）

The Effect of Lovastatin Combined with Calcitonin on Fracture Repair in Osteoporotic Rats

CAO Guolong1,LIU Xiaopo1,FENG Yunbo1,TIAN Faming2
1 Department of Orthopedic Surgery of Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China;2 Medical Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo investigate the effects of lovastatin alone or combined with calcitonin on fracture repair in osteoporotic rats.MethodsForty 4-month-old female SD rats were randomized into 5 groups（8 rats in each group）:normal fractured group(A),osteoporotic fractured group(B),lovastatin treatment group(C),calcitonin treatment group(D)and lovastatin combined with calcitonin treatment group.All rats except group A

bilateral ovariectomy.The midshaft femur fracture model was established in all rats 8 weeks after operation.The serum level of procollagen amino-terminal propeptide(PINP)was assessed by ELISA.X-ray and bone mineral density detection was used to observe the fracture healing process.The maximal loading of femoral fractures was analyzed by biomechanical method.Results(1)The serum level of PINP was significantly lower in group A than that of other groups.There was a significantly higher level of PINP in group C and group E than that of group B,and the level of PINP was significantly lower in group D than that of group C.(2)The X-ray showed more progressed fracture healing in group A and group E.The accordingly score indicated that there was a markedly higher score in groups A and group E compared to that of other three groups.(3)There was a highest bone mineral density in the full-length and in the middle of femur bone in group A,followed by group E,group D and group C.The lowest bone mineral density was found in group B.(4)The biomechanical test showed that the maximal loading in femur fracture side was significantly higher in group A than that of other four groups,in which it was higher in group E than that of group B.ConclusionThe osteoporosis decreased bone mass and delayed fracture healing process in rat model.The treatment of lovastatin combined with calcitonin showed more positive effect on preventing bone loss and promoting fracture repair than lovastatin alone.

osteoporosis；fractures,bone；lovastatin；calcitonin；bone density；disease models,animal

R683 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.014

1唐山市工人醫(yī)院骨外科（郵編063000）；2河北聯(lián)合大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心

△通訊作者 E-mail：tfm9911316@163.com