李曉文 袁 俐 張俊平 李建勇 姜忠敏 盛 鳳 劉曉智△

宮頸癌側(cè)群細(xì)胞的惡性行為特征分析*

李曉文1袁 俐1張俊平1李建勇1姜忠敏2盛 鳳3劉曉智3△

目的觀察分析宮頸癌患者腫瘤干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞的惡性行為特征。方法取4例宮頸癌患者的宮頸癌組織，原代培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分離宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞，MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，Transwell培養(yǎng)體系比較兩群細(xì)胞的侵襲能力，軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘤細(xì)胞的克隆能力，免疫熒光方法檢測(cè)耐藥基因ATP結(jié)合體超家族成員2（ABCG2）的蛋白表達(dá)情況；于20只去胸腺小鼠腹股溝皮下接種兩群細(xì)胞，各10只，比較其體內(nèi)成瘤率。結(jié)果宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的1.39%；與非側(cè)群細(xì)胞相比，側(cè)群細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，具有更強(qiáng)的瘤細(xì)胞侵襲力和克隆形成能力，且ABCG2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平更高。側(cè)群細(xì)胞體內(nèi)成瘤率為100%（10/10），而非側(cè)群細(xì)胞為20%（2/10）；瘤體病理組織切片可見(jiàn)腫瘤形成，內(nèi)部伴大片組織壞死。結(jié)論宮頸癌腫瘤干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞具有更高的惡性細(xì)胞表型，是未來(lái)宮頸癌基因治療的核心靶點(diǎn)。

宮頸腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；側(cè)群細(xì)胞；侵襲；耐藥性

宮頸癌是嚴(yán)重危害女性生命健康的疾病之一，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤第2位，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居首位[1]。如何改善宮頸癌的治療效果，提高生存率是宮頸癌研究的一大難題[2]。近年來(lái)有研究認(rèn)為，宮頸癌干細(xì)胞的存在是常規(guī)放射治療以及化學(xué)藥物治療失敗導(dǎo)致宮頸癌復(fù)發(fā)的根源[3-4]。但有關(guān)宮頸癌干細(xì)胞的鑒別、不同細(xì)胞亞群的惡性行為特征以及腫瘤細(xì)胞耐藥性等問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)對(duì)宮頸癌類干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞進(jìn)行原代分離培養(yǎng)，并就其部分生物學(xué)特征進(jìn)行觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 選擇2010年—2012年于我院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療的宮頸癌患者4例，年齡45～57歲。該研究均獲得患者及家屬同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)并登記。

1.2 試劑與動(dòng)物 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogene公司），膠原酶Ⅳ（Sigma公司），低熔點(diǎn)瓊脂糖（北京鼎國(guó)公司）；兔抗人ATP結(jié)合體超家族成員 2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）多克隆抗體（美國(guó)Chemicon公司）。雄性20 g去胸腺小鼠20只，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)，溫度20～25℃，濕度（50±5）%。

1.3 宮頸癌細(xì)胞原代培養(yǎng) 取患者宮頸癌組織，于超凈臺(tái)中用D-Hanks液漂洗2次，剔除血管與壞死組織，剪切組織塊至糊狀，0.14%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶消化，移液器反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，100 μm篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中，以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)3～5 d時(shí)行第1次換液，以后每3～4 d半量換液1次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)分選側(cè)群細(xì)胞 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，在細(xì)胞懸液中加入Hoechst33342至終濃度為5 mg/L，對(duì)照實(shí)驗(yàn)選擇在加入Hoechst33342前加拮抗劑維拉帕米至終濃度50 mg/L，于37℃避光孵育90 min。1%多聚甲醛600 μL重懸，將制備好的細(xì)胞懸液入流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過(guò)細(xì)胞分選，得到宮頸癌側(cè)群細(xì)胞和非側(cè)群細(xì)胞亞群。利用MTT方法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell上室鋪基質(zhì)膠，將側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞按1×104個(gè)/孔接種于Transwell上室，每種重復(fù)8孔，下室各孔分別加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48 h后取出上室，濕棉簽拭去膜表面未穿過(guò)膜的細(xì)胞，蘇木素染色，封片后80℃烘干。倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。

1.6 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn) 6孔板孔底預(yù)鋪置0.7%瓊脂凝固，用終濃度為0.35%低熔點(diǎn)瓊脂糖工作液分別與兩群細(xì)胞懸液混勻，迅速加入6孔板中，培養(yǎng)箱中過(guò)夜凝固；次日每孔加入200 μL全培養(yǎng)基，3周后，倒置顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)大于40的克隆團(tuán)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 免疫熒光方法檢測(cè)耐藥基因ABCG2的蛋白表達(dá) 將兩群細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞爬片，蓋玻片預(yù)先用多聚賴氨酸包被，3 d后行免疫細(xì)胞熒光方法檢測(cè)。以4%多聚甲醛固定，Triton X-100處理后，磷酸鹽緩沖液平衡，山羊血清封閉30 min；吸去血清，滴加抗體工作液（1∶1 000），濕盒中4℃過(guò)夜；加入TRATIC熒光標(biāo)記二抗，Hoechst33258復(fù)染，PBS和去離子水漂洗后，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.8 體內(nèi)成瘤率比較 調(diào)節(jié)兩群細(xì)胞終濃度為1×105/μL，分別接種于20只去胸腺小鼠，各10只。接種時(shí)左手固定小鼠，于小鼠右腿與腹腔鄰接部位碘伏消毒后，用50 μL微量注射器抽取單細(xì)胞懸液皮下潛行一段距離后勻速注入，留針1 min后，緩慢退出針頭防止返液。接種后，置恒溫[（25±2）℃]、恒濕（45%～50%）的無(wú)菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)，每日觀察記錄腫瘤生成和生長(zhǎng)情況。細(xì)胞接種后28 d行腫瘤組織標(biāo)本HE染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分選側(cè)群細(xì)胞結(jié)果 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的1.39%，非側(cè)群細(xì)胞占98.61%，見(jiàn)圖1。

Figure 1 The cervical cancer stem cell-like side population cells isolated by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)分選宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞增殖速度較快，大致呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，非側(cè)群細(xì)胞則生長(zhǎng)緩慢，無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)特點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

Figure 2 Comparison of growth curves between side population and non-side population cells of cervical cancer圖2 宮頸癌側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖比較

2.3 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞、非側(cè)群細(xì)胞平均侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為每高倍視野（46.1±7.4）、（1.4±0.3）個(gè)，側(cè)群細(xì)胞高于非側(cè)群細(xì)胞（t=19.732，P ＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.4 軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞平均每高倍視野形成細(xì)胞數(shù)大于40的集落數(shù)為（13.5±3.4）個(gè)，非側(cè)群細(xì)胞則僅見(jiàn)到極少個(gè)小細(xì)胞克隆團(tuán)，未見(jiàn)到細(xì)胞數(shù)大于40的集落，見(jiàn)圖4。

2.5 抗藥基因ABCG2的蛋白表達(dá) 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞中抗藥基因ABCG2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，且主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿和胞膜，見(jiàn)圖5。

2.6 體內(nèi)成瘤率比較 宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞在去胸腺小鼠皮下成瘤率為100%（10/10），而非側(cè)群細(xì)胞為20%（2/10），且其腫瘤體積相對(duì)較小，見(jiàn)圖6A。瘤體病理組織切片可見(jiàn)腫瘤形成，內(nèi)部伴大片組織壞死，見(jiàn)圖6B。

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中，具有自我更新、多向分化潛能、高耐藥性及高致瘤性等特點(diǎn)的一群細(xì)胞，約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的0.01%～2.00%，在腫瘤形成、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵性的作用[5-6]。先后有研究在一些實(shí)體瘤，如肺癌、腦膠質(zhì)瘤、前列腺癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌等癌組織中分離獲得了腫瘤干細(xì)胞[7]。但是從子宮頸癌組織中分離獲得腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道較少，對(duì)其生物學(xué)特性認(rèn)識(shí)也有限。2004年Setoguchi等[8]從宮頸癌HeLa細(xì)胞株中分選出側(cè)群細(xì)胞。宋菁華等[9]研究顯示宮頸癌細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例約為（2.04±0.93）%。本研究從4例宮頸癌患者中分離培養(yǎng)得到宮頸癌細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞術(shù)分選出宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞及非側(cè)群細(xì)胞，宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的1.39%，與宋菁華等[9]的研究結(jié)果基本一致。研究顯示宮頸癌側(cè)群細(xì)胞體外增生能力強(qiáng)于非側(cè)群細(xì)胞[5,9]。本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞增殖活性明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，其增殖活性旺盛，可長(zhǎng)期傳代；而非側(cè)群細(xì)胞則增殖緩慢，無(wú)明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)特點(diǎn)，與以上研究一致。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞具有更高的細(xì)胞侵襲和克隆能力。

腫瘤干細(xì)胞有別于一般腫瘤細(xì)胞的最顯著特點(diǎn)是多藥耐藥性。研究證實(shí)其多藥耐藥性主要與一類細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的表達(dá)有關(guān)，此類膜蛋白均具有ATP結(jié)合盒式結(jié)構(gòu)，并依賴此結(jié)構(gòu)獲得ATP供能后，將積蓄在癌細(xì)胞內(nèi)的藥物“泵”至膜外而形成藥物耐受[10]。ABCG2是1998年發(fā)現(xiàn)的ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，由多藥抗性蛋白基因和多藥抗性相關(guān)蛋白基因編碼。有研究顯示ABCG2蛋白在宮頸癌標(biāo)本組織中表達(dá)增高[11]。本研究結(jié)果表明宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)水平明顯高于非側(cè)群細(xì)胞，提示ABCG2基因參與宮頸癌干細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制，并可作為基因靶向治療的潛在靶點(diǎn)之一。本研究中宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞在去胸腺小鼠皮下成瘤率為100%，而非側(cè)群細(xì)胞僅為20%，提示宮頸癌干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞較非側(cè)群細(xì)胞具有更高的體內(nèi)移植成瘤能力。

Figure 3 Comparison of invasive capacity between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=20 μm)圖3 宮頸癌側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞侵襲能力比較（標(biāo)尺=20 μm）

Figure 4 Comparison of clonogenic capacity between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=50 μm)圖4 宮頸癌側(cè)群與非側(cè)群細(xì)胞克隆形成能力比較（標(biāo)尺=50 μm）

Figure 5 Comparison of ABCG2 gene expression between side population and non-side population cells of cervical cancer(scale=20 μm)圖5 宮頸癌側(cè)群及非側(cè)群細(xì)胞中ABCG2的蛋白表達(dá)比較（標(biāo)尺=20 μm）

Figure 6 Comparison of subcutaneous tumor between side population and non-side population cells of cervical cancer in mice圖6 宮頸癌側(cè)群及非側(cè)群細(xì)胞在去胸腺小鼠皮下成瘤對(duì)照

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（2013-05-01收稿 2013-10-24修回）

（本文編輯 陳麗潔）

The Analysis of Malignant Characteristics of Side Population Cells in Patients with Cervical Cancer

LI Xiaowen1,YUAN Li1,ZHANG Junping1,LI Jianyong1,JIANG Zhongmin2,SHENG Feng3,LIU Xiaozhi3
1 Department of Obstetrics and Gynecology，The Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300450,China；2 Department of Pathology；3 The Central Laboratory

ObjectiveTo analysis the malignant performance characteristics of tumor stem cell-like side population cells in patients with cervical cancer.MethodsThe cervical cancer cells were obtained from surgical resection tumor tissue.The tumor stem cell-like side population cells were isolated by flow cytometry.The cell growth curve was drawn by MTT assay.The invasion ability of tumor cells was compared by transwell assay.The clonogenic capacity was detected by clone formation in soft agar.The expression level of ABCG2 protein,a drug-resistant gene,was detected by immunofluorescence method.Finally,these cells were transplated into the subcutaneous of de thymus mice.The rate of tumor formation was compared between groups.ResultsThe results from flow cytometry assay showed the percentage of cervical cancer stem cell-like side population cells was 1.39%.Compared with the non-side population cells,the side population cells grow quickly,showed the enhanced invasion ability and colony forming ability.There was more high expression level in ABCG2 protein of side population cells.The tumor form rate was 100%(10/10)in the side population cells and the non-side population cells was 20%(2/10).ConclusionThe cervical cancer stem cell-like side population cells have more malignant performance characteristics than that of non-side population cells,which maybe a core target for cancer gene therapy in the future.

uterine cervical neoplasms;neoplastic stem cells;side population cell;invasion;drug resistance

R737.3 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.006

*濱海新區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科技基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011BHKY007）

1天津市第五中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（郵編300450），2病理科，3中心實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者 E-mail：lxz7997@126.com