劉 棟 潘小鋼 李雅琳 張峻嶺 馬慧軍

鞣花酸抑制黑素細(xì)胞黑素合成及黑素傳遞的實(shí)驗(yàn)研究*

劉 棟1潘小鋼1李雅琳1張峻嶺1馬慧軍2△

目的觀察鞣花酸對(duì)黑素細(xì)胞（melanocyte,MC）合成黑素以及傳遞黑素的影響并探討其機(jī)制。方法分別純化培養(yǎng)來自人包皮的表皮黑素細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)，傳第2代后以1∶10的比例將兩細(xì)胞接種到3 cm×3 cm的小培養(yǎng)皿中，單獨(dú)或混合培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)高、中、低（100、10、1 mg/L）3種濃度的鞣花酸干預(yù)48 h后，分別檢測(cè)干預(yù)前后黑素細(xì)胞中黑素含量、酪氨酸酶活性的變化，采用流式法檢測(cè)混合培養(yǎng)細(xì)胞中黑素傳遞的情況，以10 nmol/L熊果苷為陽性對(duì)照。結(jié)果3種濃度鞣花酸濃度均可下調(diào)細(xì)胞酪氨酸酶活性，并呈濃度依賴性。除了1 mg/L的鞣花酸對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成無明顯作用，其余濃度的鞣花酸均可降低黑素含量。鞣花酸同時(shí)具有抑制黑素傳遞的作用。結(jié)論鞣花酸可抑制黑素合成及黑素傳遞，或可作為一種皮膚美白劑應(yīng)用。

鞣花酸；黑素細(xì)胞；一元酚單氧酶；角蛋白細(xì)胞

鞣花酸最早提取自南美的塔拉樹，是一種天然植物精華，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，目前其主要來源于草莓和綠茶。有臨床資料顯示外用鞣花酸對(duì)黃褐斑治療有效，但具體的作用機(jī)制不明[1]。本研究以不同濃度的鞣花酸干預(yù)體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞（melanocyte,MC）和角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)，觀察黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、黑素含量以及處理前后黑素傳遞的情況，旨在研究鞣花酸治療黃褐斑的深層藥理機(jī)制，為更好地開發(fā)和利用抗黑素產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 鞣花酸、左旋多巴(L-dopa)、二甲基亞砜(DMSO)、分離酶(dispase)、霍亂毒素(CT)、佛波酯（TPA）、MCDB153培養(yǎng)基均購自美國Sigma公司，脫氧膽酸鈉(美國Amersco公司)，角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（keratinocyte serum free medium,K-SFM）為美國Gibco公司產(chǎn)品，兔抗人多克隆廣譜角蛋白抗體、鼠抗人單克隆NKI/beteb抗體、FITC交聯(lián)的羊抗鼠IgG、PE交聯(lián)的驢抗兔IgG抗體（美國abcam公司），25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，胎牛血清(?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司)，高速冷凍離心機(jī)、722分光光度計(jì)(上海精密分析儀器有限公司），Clinibio128c酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（澳大利亞Clinibio公司）。FACSAriaⅡ分選型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 MC和KC的純化和培養(yǎng) 取包皮環(huán)切手術(shù)患者的包皮標(biāo)本，去除皮下組織后剪成1 cm×1 cm的小片，0.25%分離酶4℃放置12～16 h，眼科鑷輕輕分離表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮5～10 min，用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素，0.05 mg/L CT，50 nmol/L TPA的MCDB153培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，取傳2代的純化的表皮黑素細(xì)胞（經(jīng)HMB45單抗免疫組化和fontanamasson染色證實(shí)），待生長至融合狀態(tài)，以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，然后接種至25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，濃度為1×105個(gè)/cm2，液體量5 mL/瓶。細(xì)胞接種12 h后，用含藥物的新鮮培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)孵育72 h后收獲細(xì)胞并計(jì)數(shù)，參照文獻(xiàn)[2]的方法測(cè)定酪氨酸酶活性和黑素含量。

1.2.2 表皮MC與KC共培養(yǎng) 將已純化的表皮MC消化離心后與純化培養(yǎng)的KC以1∶10的比例貼壁培養(yǎng)于3 cm×3 cm的小培養(yǎng)皿中，添加K-SFM培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，3 d換液1次，用100 nmol/L α-黑色素細(xì)胞雌激素（α-MSH）干預(yù)細(xì)胞3 d，未添加藥物的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，倒置顯微鏡下觀察共培養(yǎng)細(xì)胞生長及形態(tài)學(xué)變化，用于黑素傳遞的測(cè)試。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 鞣花酸貯液用MCDB153配制成濃度為10 g/L的母液，-20℃保存，臨用時(shí)用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度，其實(shí)驗(yàn)濃度為1、10、100 mg/L，觀察24、72 h時(shí)的指標(biāo)變化?？瞻讓?duì)照組僅加入相應(yīng)溶媒，每一處理因素重復(fù)測(cè)定4次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)黑素傳遞 參考文獻(xiàn)[3]，共培養(yǎng)細(xì)胞接種至底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶后，分別加入含有1、10、100 mg/L 3個(gè)濃度梯度鞣花酸的培養(yǎng)液各3 mL，空白對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液和相應(yīng)溶媒，共培養(yǎng)24 h后分別用抗鼠抗人角蛋白（1∶200）和NKI/beteb（1∶200）單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，加入羊抗鼠的免疫熒光抗體IgG（1∶500稀釋），37℃孵育20 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每一處理因素重復(fù)測(cè)量3次。以發(fā)生傳遞的KC占總KC的百分比表示黑素傳遞量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的鞣花酸對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影響 見表1。3種濃度鞣花酸濃度均可下調(diào)細(xì)胞酪氨酸酶活性，并呈濃度依賴性。除1 mg/L的鞣花酸對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成無明顯作用，其余濃度的鞣花酸均可降低黑素含量。

2.2 鞣花酸對(duì)黑素傳遞的影響 鞣花酸在1 mg/L即顯示有抑制黑素傳遞作用，與空白對(duì)照組相差異比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨濃度增加其抑制作用亦增加，見圖1、2。

Table 1 Effects of ellagic acid on melanogenesis of human epidermal melanocytes表1 鞣花酸對(duì)表皮黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影響 （n=4±s）

Table 1 Effects of ellagic acid on melanogenesis of human epidermal melanocytes表1 鞣花酸對(duì)表皮黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影響 （n=4±s）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組（0 mg/L）比較,P ＜ 0.05

鞣花酸濃度（mg/L）011 0 100 F酪氨酸酶活性24 h 325.26±34.12 254.58±27.30a229.23±21.25a153.45±17.96a102.73＊＊72 h 378.39±41.24 275.98±32.47a257.35±14.89a178.57±12.67a126.49＊＊黑素含量24 h 331.57±47.64 356.16±32.15 312.48±25.79a225.56±19.45a102.65＊＊72 h 410.72±48.16 397.63±40.56 322.66±35.29a256.43±23.22a98.07＊＊

Figure1 Flow cytometry analysis of the effect of ellagic acid on melanin transfer in co-cultured human melanocytes and keratinocytes圖1 不同劑量鞣花酸對(duì)混合培養(yǎng)細(xì)胞黑素傳遞的流式細(xì)胞圖

Figure 2 Effects of ellagic acid on melanin transfer圖2 不同濃度鞣花酸對(duì)黑素傳遞的影響

3 討論

皮膚顏色主要受色素沉著的影響，色素沉著是表皮內(nèi)KC和MC相互作用的共同結(jié)果。此過程包括4個(gè)連續(xù)的步驟：（1）黑素小體在MC內(nèi)的裝配與黑素合成。（2）黑素小體從MC核周向樹突遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。（3）黑素小體傳遞至鄰近KC。（4）黑素小體在KC內(nèi)再分布、降解[4]。研究證實(shí)，皮膚色素沉著主要依賴于MC合成黑素以及黑素小體向周圍KC傳遞的能力大小。

鞣花酸又稱沒食子酸、胡頹子酸，是廣泛存在于各種軟果、堅(jiān)果等植物組織中的一種天然多酚成分。20世紀(jì)50年代，國外已經(jīng)開始對(duì)鞣花酸進(jìn)行研究，80年代國外已將其應(yīng)用于臨床試驗(yàn)階段。近十年來，由于發(fā)現(xiàn)了鞣花酸的抗突變、抗癌效應(yīng)以及其可以作為美白劑而引起了人們更大的關(guān)注。對(duì)鞣花酸的生理作用及其機(jī)制的研究也越來越受到重視。既往有研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸體外可抑制黑素細(xì)胞中酪氨酸酶的活性以及阻斷黑素生成[5]。臨床顯示外用鞣花酸具有與熊果苷類似的美白作用[1]。本研究發(fā)現(xiàn)：1 mg/L鞣花酸即具有一定的黑素合成抑制作用，且隨著濃度的增加其作用有增加的趨勢(shì)，即可呈濃度依賴性地減少黑素細(xì)胞黑素含量及酪氨酸酶活性。因此，鞣花酸可作為一種潛在的安全有效的美白劑，其美白作用與抑制黑素細(xì)胞合成黑素以及抑制黑素小體從黑素細(xì)胞向角質(zhì)形成細(xì)胞的傳遞有關(guān)。

[1] Ertam I,Mutlu B,Unal I,et al.Efficiency of ellagic acid and arbutin in melasma:a randomized,prospective,open-label study[J].J Dermatol,2008,35(9):570-574.

[2]劉棟,朱文元,譚城.糖皮質(zhì)激素對(duì)培養(yǎng)Cloudman S91黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J].臨床皮膚科雜志,2002,32(1):3-6.

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[4]廖非,劉棟,徐麗敏.黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2009,8(2):125-127.

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（2013-06-15收稿 2013-10-28修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of Ellagic Acid on Melanogenesis and Melansome Transfer

LIU Dong1,PAN Xiaogang1,LI Yalin1,ZHANG Junling1,MA Huijun2
1 Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Tianjin Traditional Chinese Medicine Research Institute,Tianjin 300021,China;2 Department of Dermatology,The 309 Hospital of Chinese People’s Liberation Army

ObjectiveTo investigate the effect of ellagic acid on human epidermal melanocyte melanogenesis and melanin transfer,and the mechanism thereof.MethodsThe human melanocytes and and keratinocytes were co-cultured and purified.After passing the second generation,cells of 1∶10 ratio were inoculated into the small dish(3 cm × 3 cm).The changes of melanin content and tyrosinase activity in melanocytes were detected before and after intervention with ellagic acid(100,10 and 1 mg/L)for 48 h.The melanin transfer in cultured cells was detected by flow cytometry method.The 10 nmol/L arbutin was used as the positive control.ResultsThe tyrosinase activity was down-regulated by ellagic acid in a dose-dependent manner.The ellagic acid can reduce the melanin content except for the 1 mg/L of ellagic acid.The melanin transfer was also inhibited by ellagic acid in a dose-dependence manner.ConclusionEllagic acid can be used for skinwhitening cosmetic and the depigmenting effect might be due to the down-regulation of melanogenesis and melanin transfer.

ellagic acid；melanocytes；monophenol monooxygenase；keratinocytes

R751 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.005

*天津市衛(wèi)生局科技基金（項(xiàng)目編號(hào)：06KY01）;廣州寶潔有限公司（P&G）科技基金

1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院皮膚科（郵編300021）；2北京,解放軍第309醫(yī)院皮膚科

△通訊作者 E-mail:melanocytes@163.com