王躍華+陳燕+張玨+張紅玉+游亞莉+田孟良+

摘要：以華重樓［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］植物多種器官為外植體，經(jīng)不同消毒處理和培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，觀察其愈傷組織的誘導(dǎo)生長情況；并以ＴTＣ法檢測誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織中的薯蕷皂苷含量。結(jié)果表明，華重樓的隱芽、內(nèi)層芽鞘、根莖、預(yù)處理后根莖和子房外植體經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，均可不同程度地產(chǎn)生愈傷組織；其中以預(yù)處理后根莖外植體產(chǎn)生的愈傷組織生長速度最快，誘導(dǎo)率也最高，為３３．５％。經(jīng)檢測結(jié)果顯示，多次繼代培養(yǎng)的華重樓愈傷組織中含有與華重樓對(duì)照藥材和薯蕷皂苷對(duì)照品相同的薯蕷皂苷或其類似物。

關(guān)鍵詞：華重樓［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］；外植體；誘導(dǎo)；愈傷組織

中圖分類號(hào)：Ｑ８１５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1936-05

Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ of Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ Ｓａｐｏｎｉｎ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ vａｒ． Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Franch.） Hara

ＷＡＮＧ Ｙｕｅ－ｈｕａ１， ＣＨＥＮ Ｙａｎ２， ＺＨＡＮＧ Ｊｕｅ１， ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｙｕ１， ＹＯＵ Ｙａ－ｌｉ１， ＴＩＡＮ Ｍｅｎｇ-ｌｉａｎｇ３

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１０１0６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｉｃｈｕａｎ Ｊｉｎｔｕｄｉ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１１１３０，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｒｕｒａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＹａＡｎ ６２５０１４， Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Tｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎs ｏｆ Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ were used as ｅｘｐｌａｎｔｓ and were ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｙ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｓｅｒｉｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ. Tｈｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｆ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒａｌ ｃａｌｌｕｓ was detected by TTC． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔｅｓ， ｉｎｎｅｒ ｃｏｌｅｏｐｔｉｌｅ， ｒｈｉｚｏｍｅ， ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｏｖａｒｙ could ｐｒｏｄｕｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｉｎｇ. Aｍｏｎｇ ｔｈｅｍ ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｂｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｒｈｉｚｏｍｅ ｗａｓ ｆａｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｏ ３３．５％． Ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃａｌｌｕｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｒ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｕｅ ｗｉｔｈ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｎｄ ｄｉｏｓｃｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ． Tｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｘｐｌａｎｔ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ was screened out. Cａｌｌｕｓ could ｂｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ. Tｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｄｉｏｓｃｉｎ ｏｒ ｉｔｓ ａｎａｌｏｇｕｅ ｗｉｔｈ ｒｈｉｚｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ. Iｔ will ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｗａｙ ｆｏｒ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ； ｅｘｐｌａｎｔｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｃａｌｌｕｓ

重樓（Ｒｈｉｚｏｍａ ｐａｒｉｄｉｓ）是名貴中藥材之一，全世界共有２４種，我國擁有１９種，其中以西南地區(qū)各省的種類和資源尤為豐富［１］。重樓為百合科植物華重樓（七葉一枝花）［Ｐａｒｉｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｆｒａｎｃｈ．）Ｈａｒａ］和滇重樓［Ｐ． ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ Ｓｍｉｔｈ ｖａｒ． ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ（Ｆｒａｎｃｈ．） Ｈａｎｄ-Ｍａｚｚ］的干燥根莖［２］。重樓主要有效成分是甾體皂苷，其苷元主要為異螺甾烷醇類的薯蕷皂苷元和偏諾皂苷元［３］?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓具有抗腫瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒、避孕等作用，其良好的療效使其已被眾多的制藥工業(yè)用于藥劑的生產(chǎn)中，是云南白藥、宮血寧、熱毒清等重要中成藥的主要成分，用途極廣泛［４－８］。

隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，重樓藥材的需求量正以每年２０％的幅度遞增，而當(dāng)前重樓主要靠采挖野生資源。由于長期過度采挖，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，重樓已被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材瀕危物種，也是云南?。常皞€(gè)重要瀕危藥用植物之一［９，１０］。利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用植物具有生長周期短、繁殖率高等優(yōu)點(diǎn)，還能降低災(zāi)害性氣候?qū)χ参锷L的不利影響。因此積極開展對(duì)重樓植物的組織培養(yǎng)研究是解決當(dāng)前重樓藥材嚴(yán)重短缺和更好地保護(hù)其野生植物資源的有效方法。然而到目前為止，重樓植物的組織培養(yǎng)研究都還未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展［１１－１３］，也未獲得含有重樓有效成分皂苷的愈傷組織。

本研究針對(duì)當(dāng)前重樓植物在組織培養(yǎng)研究過程中存在的諸多問題，以華重樓的多種器官為外植體，開展了大量有針對(duì)性的研究工作，以期利用組織培養(yǎng)技術(shù)有效解決重樓植物快速無性繁育的瓶頸問題以及為生產(chǎn)重樓植物次生代謝產(chǎn)物提供參考。

１ 材料與方法

１．１材料

１．１．１樣品重樓藥材采自四川省都江堰市，經(jīng)四川大學(xué)張浩教授鑒定為百合科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）重樓屬（Ｐａｒｉｓ Ｌｉｎｎａｅｕｓ）植物華重樓的根莖；薯蕷皂苷對(duì)照品（批號(hào)：１１１７０７－２００５０１），由中國藥品生物制品鑒定所提供。

１．１．２藥品與試劑甲醇（批號(hào)：２００７０８３０）、三氯甲烷（批號(hào)：２０１１０５２４）、硫酸均由成都科龍化工試劑廠提供（批號(hào)：２００８０７２１）；純凈水，藍(lán)光飲用純凈水；其他試劑均為分析純。

１．１．３儀器硅膠Ｇ板，由上海信誼儀器廠提供；紫外燈，由無錫科達(dá)儀器廠提供。

１．２方法

１．２．１華重樓各營養(yǎng)器官外植體消毒和愈傷組織誘導(dǎo)選取華重樓生長健康的隱芽，從隱芽上剝離的內(nèi)層芽鞘、根、幼葉、地上莖、根莖和預(yù)處理后根莖（切取倒苗后重樓帶芽的前兩節(jié)根莖，移栽到土壤中待其有新根長出時(shí)，挖出移栽體，再切去前端的芽體和后面一節(jié)根莖，只保留靠近芽體部分的第一節(jié)根莖，即為預(yù)處理后根莖）等為外植體。在超凈工作臺(tái)上先將各外植體經(jīng)７０％乙醇消毒３０ ｓ，再用０．１％升汞溶液消毒，其中隱芽、內(nèi)層芽鞘和幼葉消毒６ ｍｉｎ，地上莖消毒８ ｍｉｎ，根、根莖及預(yù)處理后根莖消毒１２ ｍｉｎ，最后用無菌水沖洗５次，并用吸水紙吸干各外植體水分；將消毒完成的外植體切成適當(dāng)大小后接種于 ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ培養(yǎng)基中，在溫度（２０±２） ℃，光照時(shí)間１２ ｈ／ｄ，光照度１ ０００～１ ５００ ｌｘ的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)６５ ｄ，統(tǒng)計(jì)各外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況。

１．２．２華重樓花各組織外植體消毒和愈傷組織誘導(dǎo)選取華重樓植物花的花萼、花瓣、花藥、花絲、子房和花亭為外植體，在超凈工作臺(tái)上先用０．１％升汞消毒處理，其中花萼、花亭和子房消毒８ ｍｉｎ，花瓣、花絲和花藥消毒３ ｍｉｎ，再用無菌水沖洗３次，并用吸水紙吸干材料表面水分后將花萼、花瓣、花絲和花藥直接接入培養(yǎng)基中，花亭和子房縱切成兩半后再接入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件與“１．２．１”相同。

１．２．３華重樓愈傷組織增殖選取經(jīng)預(yù)處理后根莖外植體產(chǎn)生的白色和淺黃白色生長狀況良好的愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基中，分別取培養(yǎng)生長５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和６０ ｄ的愈傷組織并稱重，繪制愈傷組織的增殖生長曲線。

１．２．４細(xì)胞存活率檢測試驗(yàn)培養(yǎng)材料的細(xì)胞存活率檢測采用氯化三苯基四氨唑還原法，簡稱ＴＴＣ法［１４］。

１．２．５愈傷組織中薯蕷皂苷含量測定對(duì)照品溶液的制備：取薯蕷皂苷對(duì)照品（使用前于五氧化二磷干燥器中干燥１２ ｈ以上）適量，準(zhǔn)確稱?。?ｍｇ，加甲醇配制成１ ｍｇ／ｍＬ的對(duì)照品溶液。

華重樓對(duì)照藥材溶液的制備：取華重樓藥材于５５ ℃烘干后粉碎過４０目篩制得粉末。取粉末０．５ ｇ，加８５％乙醇１０ ｍＬ，加熱回流３０ ｍｉｎ后濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

供試品１的制備：選取繼代培養(yǎng)５代的華重樓愈傷組織按對(duì)照藥材溶液的制備方法進(jìn)行制備。

供試品２的制備：選取繼代培養(yǎng)２代的華重樓愈傷組織按對(duì)照藥材溶液的制備方法進(jìn)行制備。

空白對(duì)照品的制備：?。福担ヒ掖既芤鹤鳛榭瞻讓?duì)照品溶液。

１．２．６數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果以x±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ １９．０軟件進(jìn)行方差分析，新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，其中Ｐ＜０．０５為差異顯著，Ｐ＜０．０１為差異極顯著。

２結(jié)果與分析

２．１華重樓各營養(yǎng)器官外植體愈傷組織誘導(dǎo)

本試驗(yàn)選取華重樓７個(gè)不同部位的營養(yǎng)器官經(jīng)消毒處理后接入ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)６５ ｄ后統(tǒng)計(jì)其外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況結(jié)果見表１。

從表１可以看出，華重樓植物的隱芽、內(nèi)層芽鞘、未預(yù)處理根莖和預(yù)處理后根莖４個(gè)部位的外植體都能不同程度地誘導(dǎo)出愈傷組織，其中經(jīng)預(yù)處理后根莖外植體愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于其他外植體，為（３３．５±１．６）％（Ｐ＜０．０１）。經(jīng)預(yù)處理后根莖外植體在接入培養(yǎng)基后３０～４０ ｄ就出現(xiàn)明顯的啟動(dòng)現(xiàn)象，根莖橫切面的顏色由最初的白色變?yōu)闇\棕黃色，并且其器官內(nèi)的基本組織會(huì)產(chǎn)生明顯地體積膨大，常將根莖的皮部組織脹破，最終使得基本組織向外膨出，隨后在膨出的基本組織表面產(chǎn)生大量的白色愈傷組織，形如花菜狀、質(zhì)地較緊密（圖１）；未預(yù)處理根莖在培養(yǎng)過程中，組織膨出不明顯，其愈傷組織的誘導(dǎo)率也較低為（１９．６±１．３）％，產(chǎn)生的愈傷組織顏色為白色和黃色，其產(chǎn)生數(shù)量也較少（圖２）；隱芽外植體在接入培養(yǎng)基的初期，主要表現(xiàn)為芽體的整體膨大，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，有部分隱芽出現(xiàn)了抽苗現(xiàn)象，但始終未見有愈傷組織產(chǎn)生（圖３）；而另一部分隱芽在體積膨大的基礎(chǔ)上，逐漸愈傷化（圖４），培養(yǎng)６５ ｄ后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率為（１２．８±１．３）％。內(nèi)層芽鞘外植體在接入培養(yǎng)基２５ ｄ左右，芽鞘體積膨大而呈肥厚肉質(zhì)，并在接下來的培養(yǎng)過程中，可觀察到膨大芽鞘的內(nèi)表面和邊緣逐漸長出質(zhì)地較緊密、顏色為白色的團(tuán)塊狀愈傷組織（圖５）。

而華重樓的幼葉、地上莖和根外植體在培養(yǎng)６５ ｄ后都未觀察到有愈傷組織的產(chǎn)生；盡管幼葉和地上莖也能在培養(yǎng)基中保持較長時(shí)間的活力，而且幼葉膨大也非常明顯（圖６），但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，幼葉會(huì)逐漸枯萎死亡，而地上莖則會(huì)因褐化而死亡；根外植體在接入培養(yǎng)基后，一直未發(fā)生形態(tài)上的變化，并且染菌率也低，這與Cheung等［７］的研究結(jié)果相似，在培養(yǎng)８０ ｄ后用ＴＴＣ法檢測培養(yǎng)的根細(xì)胞存活率僅為（４．５±０．２）％。

２．２華重樓花各器官外植體的愈傷組織誘導(dǎo)

華重樓花各器官外植體也接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)６０ ｄ后統(tǒng)計(jì)各外植體的情況結(jié)果見表２。從表２可以看出，６種不同外植體在接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)６０ ｄ后，只觀察到子房外植體有少量愈傷組織的產(chǎn)生。子房產(chǎn)生愈傷組織的部位主要在子房切面的子房壁傷口處有少量顏色為黃色和黃褐色零星顆粒狀愈傷組織產(chǎn)生（圖７）；子房產(chǎn)生的愈傷組織生長時(shí)間很短也就停止了，其原因主要是因?yàn)樽臃勘趥谠谂囵B(yǎng)過程中產(chǎn)生褐變較嚴(yán)重的緣故。

花萼和花絲外植體在接入培養(yǎng)基后大多會(huì)出現(xiàn)膨大，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，最終都出現(xiàn)枯萎死亡；而花瓣和花藥外植體在接入培養(yǎng)基后，形態(tài)不發(fā)生變化，在培養(yǎng)８０ ｄ后用ＴＴＣ法檢測其細(xì)胞均已死亡；花亭外植體在接入培養(yǎng)基后，部分可在節(jié)處可產(chǎn)生一定的膨大，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，外植體會(huì)產(chǎn)生褐變而死亡。

２．３華重樓愈傷組織的增殖

選經(jīng)預(yù)處理后根莖外植體產(chǎn)生的白色和淺黃白色愈傷組織２ ｇ／Ｌ接入ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的增殖培養(yǎng)基中，每隔５ ｄ取樣稱重并觀察其生長情況，繪制出愈傷組織增殖生長曲線見圖8。從圖8可以看出，在華重樓愈傷組織的增殖生長過程中，延遲期時(shí)間較長為１５～２０ ｄ左右；此后愈傷組織生長進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，并開始迅速增殖生長。對(duì)數(shù)生長期持續(xù)時(shí)間為２０～２５ ｄ 左右，在此時(shí)間段愈傷組織細(xì)胞可增殖２倍多；此后，愈傷組織增殖生長進(jìn)入平穩(wěn)期，其增殖速度也明顯減慢。

２．４薯蕷皂苷含量的測定結(jié)果

按照《中華人民共和國藥典》２０１０版薄層色譜法（附錄ＶＩＢ）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各５ μL以及對(duì)照品溶液１０ μL，分別點(diǎn)于同一硅膠Ｇ薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（體積比１５∶５∶１）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴１０％硫酸乙醇溶液在１０５ ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別至日光燈和紫外光燈（３６５ ｎｍ）下檢視。

由圖９、表３可以看出，供試品１（繼代培養(yǎng)５代的華重樓愈傷組織）與對(duì)照藥材和對(duì)照品都有顏色相同、遷移率相當(dāng)?shù)娘@色斑點(diǎn)， 表明繼代培養(yǎng)５代的華重樓愈傷組織中具有薯蕷皂苷或其類似物；供試品２（繼代培養(yǎng)２代華重樓愈傷組織）不含與對(duì)照品相同的斑點(diǎn)，但在Ｒｆ＝０．６１１處的斑點(diǎn)與對(duì)照藥材和供試品１相當(dāng)，表明繼代培養(yǎng)２代華重樓愈傷組織不含有薯蕷皂苷，但含有華重樓的其他成分；試驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照品無干擾。

３小結(jié)與討論

在對(duì)華重樓愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)在適宜的時(shí)期選擇有效的外植體部位是非常重要的。本研究中所采用的兩種根莖外植體都是除去了芽體后保留的第一節(jié)的根莖，結(jié)果表明，經(jīng)預(yù)處理后的根莖外植體不僅愈傷組織誘導(dǎo)率更高，而且產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量也更多，愈傷組織的生長質(zhì)量也更好，因而也確保了后繼愈傷組織的成功增殖；本研究也曾采用了除第一節(jié)根莖以外的其他根莖作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但最終都未獲得愈傷組織，這也與延齡草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根莖誘導(dǎo)愈傷組織的情況相似［１５］；因此，華重樓植物頂芽后的第一節(jié)根莖細(xì)胞保持有較強(qiáng)的潛在分裂能力，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后較易脫分化產(chǎn)生愈傷組織。

薯蕷皂苷作為華重樓植物中的重要有效成分，是屬于植物的次生代謝產(chǎn)物。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的華重樓愈傷組織，是可以在產(chǎn)生大量初生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步產(chǎn)生薯蕷皂苷次生代謝物；因此，在重樓植物以后的組織培養(yǎng)研究過程中，可有效地通過改變培養(yǎng)基中各成分的種類、比例以及積極開展前體飼喂技術(shù)和利用發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)利用生物技術(shù)生產(chǎn)重樓植物有效成分薯蕷皂苷的目的。

本研究研究了華重樓各部位外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的情況，篩選出了經(jīng)預(yù)處理后的根莖是產(chǎn)生愈傷組織的最佳外植體，并成功地建立了華重樓愈傷組織增殖培養(yǎng)體系，為開展華重樓組培苗的生產(chǎn)和篩選出次生代謝產(chǎn)物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)奠定了工作基礎(chǔ)。

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［９］ 鐘廷瑜，舒光明，易尚平．四川重樓屬藥用植物資源研究［Ｊ］．資源開發(fā)與市場，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周濃，段寶忠，夏從龍，等．滇重樓不同生長發(fā)育期化學(xué)成分的變化規(guī)律［Ｊ］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陳麗萍， 葛方蘭．重樓屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)［Ｊ］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 楊麗云，陳翠，呂麗芬，等．云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生［Ｊ］．植物生理學(xué)通訊，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳蘭．中藥重樓的研究進(jìn)展［Ｊ］．右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 葉芳，夏勝，梅興國．紅豆杉愈傷組織超低溫保存有關(guān)因素的研究［Ｊ］． 武漢植物學(xué)研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，錢麗華，劉漢卿．瀕危植物延齡草愈傷組織誘導(dǎo)研究［Ｊ］．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．

３小結(jié)與討論

在對(duì)華重樓愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)在適宜的時(shí)期選擇有效的外植體部位是非常重要的。本研究中所采用的兩種根莖外植體都是除去了芽體后保留的第一節(jié)的根莖，結(jié)果表明，經(jīng)預(yù)處理后的根莖外植體不僅愈傷組織誘導(dǎo)率更高，而且產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量也更多，愈傷組織的生長質(zhì)量也更好，因而也確保了后繼愈傷組織的成功增殖；本研究也曾采用了除第一節(jié)根莖以外的其他根莖作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但最終都未獲得愈傷組織，這也與延齡草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根莖誘導(dǎo)愈傷組織的情況相似［１５］；因此，華重樓植物頂芽后的第一節(jié)根莖細(xì)胞保持有較強(qiáng)的潛在分裂能力，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后較易脫分化產(chǎn)生愈傷組織。

薯蕷皂苷作為華重樓植物中的重要有效成分，是屬于植物的次生代謝產(chǎn)物。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的華重樓愈傷組織，是可以在產(chǎn)生大量初生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步產(chǎn)生薯蕷皂苷次生代謝物；因此，在重樓植物以后的組織培養(yǎng)研究過程中，可有效地通過改變培養(yǎng)基中各成分的種類、比例以及積極開展前體飼喂技術(shù)和利用發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)利用生物技術(shù)生產(chǎn)重樓植物有效成分薯蕷皂苷的目的。

本研究研究了華重樓各部位外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的情況，篩選出了經(jīng)預(yù)處理后的根莖是產(chǎn)生愈傷組織的最佳外植體，并成功地建立了華重樓愈傷組織增殖培養(yǎng)體系，為開展華重樓組培苗的生產(chǎn)和篩選出次生代謝產(chǎn)物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)奠定了工作基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 李恒．重樓屬植物［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，１９９８．１－７．

［２］ 國家藥典委員會(huì)．中國藥典一部［Ｚ］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，２０１０．２４３．

［３］ 張曉潔，查嶺生，陳小靜，等．一株產(chǎn)重樓皂苷內(nèi)生細(xì)菌的分離與鑒定［Ｊ］．微生物學(xué)通報(bào)，２００６，３３（５）：８４－８８．

［４］ 張霄霖，劉月蟬． 重樓的研究與應(yīng)用［Ｊ］．中國中醫(yī)藥科技，２０００，７（５）：３４６－３４７．

［５］ 湯海峰，趙越平，蔣永培．重樓屬植物的研究概況［Ｊ］．中草藥，１９９８，２９（１２），８３９－８４３．

［６］ 馬云淑，桂鏡生，朱燕，等．滇產(chǎn)重樓資源及市場情況調(diào)查［Ｊ］．云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，１９９７，２０（２）：２４－２６．

［７］ ＣＨＥＵＮＧ Ｊ Ｙ， ＯＮＧ Ｒ Ｃ， ＳＵＥＮ Ｙ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ Ｄ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｉｎ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５（２）：２０３－２１１．

［８］ ＷＡＮＧ ＧＸ， ＨＡＮ Ｊ， ＺＨＡＯ Ｌ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｐａｄｓ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ［Ｊ］． Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２０１０， １７（１４）： １１０２－１１０５．

［９］ 鐘廷瑜，舒光明，易尚平．四川重樓屬藥用植物資源研究［Ｊ］．資源開發(fā)與市場，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周濃，段寶忠，夏從龍，等．滇重樓不同生長發(fā)育期化學(xué)成分的變化規(guī)律［Ｊ］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陳麗萍， 葛方蘭．重樓屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)［Ｊ］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 楊麗云，陳翠，呂麗芬，等．云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生［Ｊ］．植物生理學(xué)通訊，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳蘭．中藥重樓的研究進(jìn)展［Ｊ］．右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 葉芳，夏勝，梅興國．紅豆杉愈傷組織超低溫保存有關(guān)因素的研究［Ｊ］． 武漢植物學(xué)研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，錢麗華，劉漢卿．瀕危植物延齡草愈傷組織誘導(dǎo)研究［Ｊ］．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．

３小結(jié)與討論

在對(duì)華重樓愈傷組織的誘導(dǎo)過程中，筆者發(fā)現(xiàn)在適宜的時(shí)期選擇有效的外植體部位是非常重要的。本研究中所采用的兩種根莖外植體都是除去了芽體后保留的第一節(jié)的根莖，結(jié)果表明，經(jīng)預(yù)處理后的根莖外植體不僅愈傷組織誘導(dǎo)率更高，而且產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)量也更多，愈傷組織的生長質(zhì)量也更好，因而也確保了后繼愈傷組織的成功增殖；本研究也曾采用了除第一節(jié)根莖以外的其他根莖作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，但最終都未獲得愈傷組織，這也與延齡草（Trillium tschonoskii Maxim.）不同部位根莖誘導(dǎo)愈傷組織的情況相似［１５］；因此，華重樓植物頂芽后的第一節(jié)根莖細(xì)胞保持有較強(qiáng)的潛在分裂能力，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后較易脫分化產(chǎn)生愈傷組織。

薯蕷皂苷作為華重樓植物中的重要有效成分，是屬于植物的次生代謝產(chǎn)物。經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的華重樓愈傷組織，是可以在產(chǎn)生大量初生代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步產(chǎn)生薯蕷皂苷次生代謝物；因此，在重樓植物以后的組織培養(yǎng)研究過程中，可有效地通過改變培養(yǎng)基中各成分的種類、比例以及積極開展前體飼喂技術(shù)和利用發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，最終實(shí)現(xiàn)利用生物技術(shù)生產(chǎn)重樓植物有效成分薯蕷皂苷的目的。

本研究研究了華重樓各部位外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的情況，篩選出了經(jīng)預(yù)處理后的根莖是產(chǎn)生愈傷組織的最佳外植體，并成功地建立了華重樓愈傷組織增殖培養(yǎng)體系，為開展華重樓組培苗的生產(chǎn)和篩選出次生代謝產(chǎn)物含量高的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)奠定了工作基礎(chǔ)。

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［９］ 鐘廷瑜，舒光明，易尚平．四川重樓屬藥用植物資源研究［Ｊ］．資源開發(fā)與市場，１９９８，１４（５）：２０２-205．

［１０］ 周濃，段寶忠，夏從龍，等．滇重樓不同生長發(fā)育期化學(xué)成分的變化規(guī)律［Ｊ］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，２０１１，１７（５）：７０-73．

［１１］ 李群，陳麗萍， 葛方蘭．重樓屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)［Ｊ］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（１）：１２０－１２２．

［１２］ 楊麗云，陳翠，呂麗芬，等．云南重樓的組織培養(yǎng)與植株再生［Ｊ］．植物生理學(xué)通訊，２００８，４４（５）：９４７－９４８．

［１３］ 唐炳蘭．中藥重樓的研究進(jìn)展［Ｊ］．右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，２００６（６）：１０６２－１０６４．

［１４］ 葉芳，夏勝，梅興國．紅豆杉愈傷組織超低溫保存有關(guān)因素的研究［Ｊ］． 武漢植物學(xué)研究，２００１，１９（４）：３２７－３３１．

［１５］ 胡天印，錢麗華，劉漢卿．瀕危植物延齡草愈傷組織誘導(dǎo)研究［Ｊ］．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００６，２９（３）：３２６－３２９．