吳亞坤+杜志強(qiáng)+王建英

摘要：以微球菌核酸酶法分離的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）染色體單核小體DNA為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)不同靶序列PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)的不同定位核小體位置。結(jié)果表明，啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近核小體位置大約在39107位到39269位、39318位到39470位及39540位到39694位之間，理論計(jì)算結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；核小體；定位；Ⅲ號(hào)染色體；自主復(fù)制序列305

中圖分類號(hào)：Q34；Q949.326.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1928-02

Location of Nucleosome around ARS305 on Chromosome III of Saccharomyces cerevisiae

WU Ya-kun，DU Zhi-qiang，WANG Jian-ying

（The Institute of Bioengineering and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，Inner Mongolia，China）

Abstract: Using the variation pattern of ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ of ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ was determined ｗｈｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｏｎｏ－ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ＤＮＡ ｏｆ Sａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ was used ａｓ ｔｈｅ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ． The results ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were ｔｈｒｅｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ａｒｏｕｎｄ ＡＲＳ３０５ of chromosome Ⅲ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ３９１０７－ ３９２６９ ｂｐ， ３９３１８－３９４７０ ｂｐ， ａｎｄ ３９５４０－ ３９６９４ ｂｐ． Cｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ； location； ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ； ＡＲＳ３０５

真核生物的染色質(zhì)以組蛋白八聚體和緊密纏繞其上147 bp的DNA片段為基本組成結(jié)構(gòu)單元，由于核小體在DNA分子上的可移動(dòng)性，相鄰核小體之間的自由DNA片段長(zhǎng)度從10 bp至100 bp不等［1］。在研究啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA分子復(fù)制過程中，發(fā)現(xiàn)許多具有自主復(fù)制活性的序列。試驗(yàn)研究表明，在自主復(fù)制序列（Autonomous replicating sequence，ARS）附近通常為核小體缺乏區(qū)域，而啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體具有強(qiáng)復(fù)制起始活性的ARS305及其附近區(qū)域卻有相對(duì)穩(wěn)定的核小體占據(jù)信號(hào)［2］。本研究從理論預(yù)測(cè)和試驗(yàn)驗(yàn)證兩方面來研究ARS305附近的核小體占據(jù)情況，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

啤酒酵母由內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)從SGD網(wǎng)站獲取啤酒酵母染色體ⅢARS305的基因序列（39159-39706），并依前后延伸后序列（39032-39761）設(shè)計(jì)15對(duì)PCR引物。

1.2.2單核小體DNA提?、贀u菌。挑取單菌落接種于2 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。②擴(kuò)大培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)物按1∶50（V/V）擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600 nm為0.9。③收集菌體。加入2%的甲醛交聯(lián)細(xì)胞作用30 min，然后用125 mmol/L的甘氨酸使反應(yīng)猝熄， 4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，并用20 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液清洗菌體1次。④原生質(zhì)體提取。將菌體重懸于6 mL A液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mol/L D-山梨醇、10 mmol/L β-巰基乙醇）中，加入終濃度為0.25 mg/mL的酵母裂解酶裂解細(xì)胞［3］，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞后，重懸于2 mL B液（1 mol/L D-山梨醇、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、0.075% Nonidet P40、1 mmol/L β-巰基乙醇和500 μmol/L亞精胺）中。⑤單核小體提取。將上述原生質(zhì)體溶液分裝為每份200 μL，用微球菌核酸酶充分消化后，加入新配制的C液（5% SDS、50 mmol/L EDTA ）終止反應(yīng)。然后用蛋白酶K法提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收單核小體DNA混合物。

1.2.3PCR定位核小體以單核小體DNA混合物為模板，用15對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果同Kaplan等［4］的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論預(yù)測(cè)結(jié)果［5］對(duì)比。

2結(jié)果與分析

2.1單核小體DNA提取結(jié)果

啤酒酵母菌染色質(zhì)用微球菌核酸酶處理后，瓊脂糖凝膠電泳顯示單核小體DNA中含有少量全基因組DNA（圖1），切膠回收單核小體DNA混合物（圖2）。

2.2PCR擴(kuò)增定位核小體結(jié)果

以單核小體DNA混合物為模板，用15對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，泳道2、3、4、7、8、9、12、13、14電泳條帶明顯，可推測(cè)引物P2/P2和P4/P4之間，P7/P7和P9/P9之間以及P12/P12和P14/P14之間對(duì)應(yīng)的區(qū)域可能被核小體占據(jù)，對(duì)應(yīng)于Ⅲ號(hào)染色體上的堿基位置為39107位到39269位以及39318位到39470位和39540位到39694位。Kaplan等［4］試驗(yàn)結(jié)果表明，在39089（67）位到39258（227）位之間以及39350（319）位到39518（487）位之間和39598（567）位到39750（719）位之間可能存在核小體。

本研究中理論預(yù)測(cè)結(jié)果為在39096（65）位到39296（231）位之間以及39323（292）位到39481（456）位和39580（549）位到39744（713）位之間可能存在核小體。試驗(yàn)實(shí)際中檢測(cè)出的核小體與理論預(yù)測(cè)及Kaplan等［4］試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

3小結(jié)與討論

核小體定位技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代，隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展而不斷地完善。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，利用計(jì)算機(jī)編程，通過全基因組測(cè)序?qū)σ痪S堿基序列的分子結(jié)構(gòu)特性分析，從而從理論上預(yù)測(cè)核小體位置的方法得到了快速的發(fā)展，已經(jīng)逐漸形成了一套芯片檢測(cè)-理論預(yù)測(cè)-試驗(yàn)驗(yàn)證的成熟試驗(yàn)體系［6-8］，為研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯(lián)關(guān)系開辟了道路。本試驗(yàn)研究了啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近的核小體定位情況，進(jìn)一步確定了ARS305作為具有強(qiáng)起始活性的自主復(fù)制區(qū)域的特殊性。

參考文獻(xiàn):

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［６］ＣＨＡＮＧ Ｆ， ＴＨＥＩＳ Ｊ Ｆ， ＭＩＬＬＥＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＲＳ３１８ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＷＴＷ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１６）：５０７１－５０８１．

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［８］肖建平，豐繼華，盧英，等． 基于核小體位置預(yù)測(cè)的酵母進(jìn)化印跡研究［Ｊ］． 生物信息學(xué)， ２０１３，１１（２）：１５０－１５２．

3小結(jié)與討論

核小體定位技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代，隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展而不斷地完善。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，利用計(jì)算機(jī)編程，通過全基因組測(cè)序?qū)σ痪S堿基序列的分子結(jié)構(gòu)特性分析，從而從理論上預(yù)測(cè)核小體位置的方法得到了快速的發(fā)展，已經(jīng)逐漸形成了一套芯片檢測(cè)-理論預(yù)測(cè)-試驗(yàn)驗(yàn)證的成熟試驗(yàn)體系［6-8］，為研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯(lián)關(guān)系開辟了道路。本試驗(yàn)研究了啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近的核小體定位情況，進(jìn)一步確定了ARS305作為具有強(qiáng)起始活性的自主復(fù)制區(qū)域的特殊性。

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3小結(jié)與討論

核小體定位技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代，隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展而不斷地完善。近年來，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，利用計(jì)算機(jī)編程，通過全基因組測(cè)序?qū)σ痪S堿基序列的分子結(jié)構(gòu)特性分析，從而從理論上預(yù)測(cè)核小體位置的方法得到了快速的發(fā)展，已經(jīng)逐漸形成了一套芯片檢測(cè)-理論預(yù)測(cè)-試驗(yàn)驗(yàn)證的成熟試驗(yàn)體系［6-8］，為研究染色質(zhì)結(jié)構(gòu)特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯(lián)關(guān)系開辟了道路。本試驗(yàn)研究了啤酒酵母Ⅲ號(hào)染色體ARS305附近的核小體定位情況，進(jìn)一步確定了ARS305作為具有強(qiáng)起始活性的自主復(fù)制區(qū)域的特殊性。

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