魏曉瑞，陶 立，李 軍，謝永平，閉炳芬，陳澤祥，韋志鋒，秦若甫，蘭美益，彭 昊，楊 威，王曉麗

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；3.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001）

自Tyzzer（1907）首次發(fā)現(xiàn)小鼠隱孢子蟲(chóng)（C.muris）以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲(chóng)病進(jìn)行了大量研究，已在人、哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)、爬行動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等多種動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)15個(gè)種類(lèi)的隱孢子蟲(chóng)感染[1-3]，其中可感染牛的隱孢子蟲(chóng)種為安氏隱孢子蟲(chóng)（C.an?dersoni）、小球隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)、牛隱孢子蟲(chóng)(C.bovis)、小鼠隱孢子蟲(chóng)(C.muris)、犬隱孢子蟲(chóng)(C.ca?nis)、貓隱孢子蟲(chóng)(C.fells)、豬隱孢子蟲(chóng)(C.suis)、鹿樣基因型（C.deer-like genotype）和賴(lài)氏隱孢子蟲(chóng)（C.ryanae）[4-5]。隱孢子蟲(chóng)對(duì)牛的感染與牛的年齡呈正相關(guān)性[6]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)廣西奶牛隱孢子蟲(chóng)病流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果顯示，廣西奶牛感染的隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)為安氏隱孢子蟲(chóng)，由于調(diào)查的時(shí)間錯(cuò)過(guò)了產(chǎn)犢高峰期，對(duì)2月齡內(nèi)犢牛的調(diào)查樣本數(shù)相對(duì)偏少，有可能造成漏檢[7]。為了更能全面準(zhǔn)確地反映廣西奶牛隱孢子蟲(chóng)感染的種類(lèi)和流行情況，本實(shí)驗(yàn)室在2011年9月至2012年1月采用醛-酯法預(yù)處理糞樣，再經(jīng)飽和糖溶液漂浮、抗酸染色法和PCR鑒定檢測(cè)了廣西7個(gè)黑白花奶牛場(chǎng)2月齡內(nèi)犢牛隱孢子蟲(chóng)感染狀況。

1 材料與方法

1.1 材料 待檢糞樣： 采集7個(gè)廣西黑白花奶牛場(chǎng)617頭2月齡以?xún)?nèi)犢牛的新鮮糞便，每頭糞樣10～30 g左右，分裝于潔凈的塑料袋內(nèi)，編號(hào)和標(biāo)記牛的日齡及自然狀況，置4℃冰箱待檢。

主要試劑及配制：乙酸乙酯溶液、10%福爾馬林溶液、飽和蔗糖溶液（食用白糖500 g，蒸餾水350 mL，石炭酸7.0 mL，比重為1.28）。改良抗酸染色液分別是甲液（堿性復(fù)紅4 g，95%酒精20 mL，石碳酸8 mL，蒸餾水100 mL）、乙液（硫酸10 mL，蒸餾水90 mL）、丙液（0.2 g孔雀綠溶于蒸餾水100 mL）。甲醇，2.5%重鉻酸鉀溶液。PCR Taq Mix、DNA Marker1，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；糞便基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

主要儀器：PCR儀，購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Alpha Inotech公司。

1.2 方法

1.2.1 犢牛糞樣處理和飽和蔗糖液漂浮 取每份糞樣5～10 g，加適量10%福爾馬林溶液，充分搗碎、攪勻，60目銅篩過(guò)濾，濾液再經(jīng)260目尼龍篩過(guò)濾，將濾液置離心管中，3000 r/min離心10 min，棄上清液后，在沉淀中加入5倍體積以上的10%福爾馬林溶液充分混勻，再加入福爾馬林溶液2/5體積的乙酸乙酯溶液充分混勻，3000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀中加入約3/4試管體積的蒸餾水充分混勻，3000 r/min離心10 min，棄上清。最后在沉淀中加適量的飽和蔗糖溶液，攪勻后3000 r/min離心10 min。用鐵絲環(huán)蘸取表層液膜制片，于400×鏡下觀察。

1.2.2 改良抗酸染色法 取1.2.1的沉淀物涂片，自然干燥，甲醇固定5 min，滴加甲液于糞膜上，5～10 min后水洗；滴加乙液，1～5 min后水洗；滴加丙液，1 min后水洗，晾干后1000×油鏡下觀察。

1.2.3 卵囊形態(tài)學(xué)鑒定 每張玻片觀察100個(gè)視野，在400×鏡下測(cè)量卵囊的大小，根據(jù)卵囊的長(zhǎng)短徑計(jì)算卵囊指數(shù)，觀察卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 PCR鑒定 取陽(yáng)性糞樣200 mg，應(yīng)用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便DNA進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定[8]。

2 結(jié)果

2.1 廣西2月齡內(nèi)犢奶牛隱孢子蟲(chóng)感染情況 共調(diào)查7個(gè)黑白花奶牛場(chǎng)，檢測(cè)糞樣617頭份，其中6個(gè)場(chǎng)為隱孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性場(chǎng)，共檢出陽(yáng)性糞樣57頭份，場(chǎng)均感染陽(yáng)性率為9.24%（表1），隱孢子蟲(chóng)卵囊的檢出與犢奶牛的年齡呈一定的相關(guān)性（圖1）。

2.2 蟲(chóng)種鑒定

圖1 隱孢子蟲(chóng)感染與犢牛日齡的關(guān)系

2.2.1 卵囊形態(tài)和大小 糞樣經(jīng)醛—酯法和飽和蔗糖溶液漂浮法處理后，用鐵絲環(huán)蘸取糞樣的表層液膜制片，于400×鏡下觀察發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(chóng)卵囊呈粉紅色，橢圓形或圓形，囊壁薄而光滑，周?chē)械G色光圈，無(wú)微孔和極粒，內(nèi)有月牙形的子孢子。經(jīng)改良抗酸染色法處理的樣品，在1000×油鏡下觀察，藍(lán)綠色的背景上卵囊呈鮮艷的玫瑰紅色，卵囊為橢圓形或圓形，囊內(nèi)有月牙形的空泡，但多數(shù)卵囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清楚（圖2）。卵囊大小為6.26μm～8.38μm×4.20 μm～5.35μm，平均7.48μm×5.23μm，卵囊形狀指數(shù)（長(zhǎng)/寬）1.07～1.60，平均為 1.36（n=100）。

圖2 隱孢子蟲(chóng)卵囊（改良抗酸染色法） （1000×）

2.2.2 PCR鑒定 應(yīng)用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便DNA進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定，結(jié)果表明檢測(cè)到的隱孢子蟲(chóng)均為安氏隱孢子蟲(chóng)（圖3）。

圖3 PCR基因分型

3 討論

對(duì)廣西7個(gè)黑白花奶牛場(chǎng)的617頭份2月齡內(nèi)犢牛糞樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣西2月齡內(nèi)犢奶牛隱孢子蟲(chóng)感染率為9.24%，57份陽(yáng)性糞樣檢測(cè)到的卵囊形態(tài)學(xué)相近或一致，經(jīng)PCR鑒定證實(shí)為安氏隱孢子蟲(chóng)，這和我們之前調(diào)查相一致[7]，說(shuō)明安氏隱孢子蟲(chóng)是感染廣西黑白花奶牛隱孢子蟲(chóng)的主要種類(lèi)。

研究表明，小球隱孢子蟲(chóng)是感染犢牛的主要隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種，其感染高峰期為1-15日齡，21-60日齡奶牛感染的蟲(chóng)種60%～90%為小球隱孢子蟲(chóng)，其余為牛隱孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)和鹿樣基因型，3-11月齡僅見(jiàn)牛隱孢子蟲(chóng)、安氏隱孢子蟲(chóng)和鹿樣基因型的感染，而無(wú)小球隱孢子蟲(chóng)感染[6-9]；Wang等(2000)也認(rèn)為小球隱孢子蟲(chóng)主要寄生于斷奶前犢牛，牛隱孢子蟲(chóng)和賴(lài)氏隱孢子蟲(chóng)主要寄生于斷奶后犢牛和青年牛，安氏隱孢子蟲(chóng)常見(jiàn)于成年牛[5]。我們的調(diào)查表明，目前廣西2月齡犢牛感染的隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)為安氏隱孢子蟲(chóng)，是否還有小球隱孢子蟲(chóng)的感染還有待深入調(diào)查。

2月齡內(nèi)犢牛由于還沒(méi)有斷奶，糞便中含脂質(zhì)較多，黏稠不易被水洗開(kāi)，即使用飽和蔗糖溶液漂浮也會(huì)因脂質(zhì)顆粒無(wú)法觀察到卵囊，用醛-酯法處理糞樣可解決糞便中脂質(zhì)的問(wèn)題，大大地提高了檢出率。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)F場(chǎng)的陽(yáng)性率特別高，達(dá)到34.0%。這與該場(chǎng)犢?；烊猴曫B(yǎng)、擁擠和環(huán)境衛(wèi)生極差有關(guān)，糞尿橫流極易污染飼料和水源，導(dǎo)致?tīng)倥５闹貜?fù)感染。因此，一定要注意犢牛的飼養(yǎng)管理，按日齡大小分群，保持合理的飼養(yǎng)密度和空間，及時(shí)清除糞便、清掃場(chǎng)地，搞好環(huán)境衛(wèi)生。

[1]Ryan U M，Monisp，Enemark H L，et al.Suis n sp(Apicomplexa:Cryptosporididae)in pigs(Susscrofa)[J].J Parasitol，2004，90(4):769-773.

[2]Fayer R，Santin M，Xiao L.Cryptosporidium bovis n sp(Apicom?plexa:Cryptosporididae)in cattle(Bos taurus)[J].J P arasitol，2005，91(3):624-629.

[3]Xiao L，F(xiàn)ayer R，Ryan U M，et al.Cryptosporidiumtaxonomy:re?centadvances and implications for public health[J].Clin Microbi?ol Rev，2004，17:72-97.

[4]梁楠，菅復(fù)春，寧長(zhǎng)申，等.牛隱孢子蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（12）：1024-1030.

[5]Wang R，Ma G，Zhao J，et al.Cryptosporidium andersoni is the predominantspecies in pose-weaned and adult dairy cattle in Chi?na[J].Parasitol Int，2011，60(1):1-4.

[6]Wade S E，Mohammed H O，Schaaf S L.Prevalence of Giardia sp，Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium muris(C.andersoni)in 109 dairy herds in five counties of southeasten New York[J].Vet Parasitol，2000，93(1):1-11.

[7]陶立，陳澤祥，韋志鋒，等.廣西奶牛隱孢子蟲(chóng)病的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（7）：742-746.

[8]彭昊，李軍，陶立，等.牛隱孢子蟲(chóng)多重PCR方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28(8):825-828.

[9]Santin M，Trout J M，Xiao Li，et al.Prevalence and age related variation of Cryptosporidium species and genotypes in dairy calves[J].Vet Parasitol，2004，122（2）:103-117.