席 磊 ，鄭 鳴，王永芬，邊傳周

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450011）

豬致病性大腸桿菌是獸醫(yī)學(xué)臨床感染中最常見(jiàn)的病原菌之一，抗生素在該病防治中的長(zhǎng)期使用和濫用，產(chǎn)生的耐藥性、藥物殘留、動(dòng)物自身免疫力降低以及對(duì)生態(tài)環(huán)境潛在危害等弊端日趨明顯[1-2]。益生菌、中藥作為新型的綠色飼料添加劑，以天然無(wú)毒、無(wú)副作用、無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì)，正在成為抗生素的替代品，受到養(yǎng)殖業(yè)青睞，是凈化養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇[3-6]。目前市售中藥、益生菌產(chǎn)品，存在以下問(wèn)題：一是缺乏針對(duì)特定豬場(chǎng)或區(qū)域病原菌開(kāi)展優(yōu)勢(shì)益生菌株與高效中藥篩選；二是產(chǎn)品多采用單一菌株、單方中藥或復(fù)合菌株、復(fù)方中藥等形式，對(duì)兩者協(xié)同使用產(chǎn)品開(kāi)發(fā)較少；三是產(chǎn)品應(yīng)用停留在疾病防治層面，沒(méi)有考慮到菌株多重耐藥性逆轉(zhuǎn)與環(huán)境凈化問(wèn)題。通過(guò)質(zhì)粒消除作用實(shí)現(xiàn)菌株耐藥性逆轉(zhuǎn)，是目前解決菌株耐藥性的研究熱點(diǎn)[7]。研究表明，不少中藥在其抗菌消炎的基礎(chǔ)上，還有消除細(xì)菌耐藥性質(zhì)粒的作用[8]。

本試驗(yàn)在前期針對(duì)87株豬致病性大腸桿菌開(kāi)展的不同生物制劑對(duì)其抑菌效果、不同中藥對(duì)其耐藥性質(zhì)粒消除作用等試驗(yàn)基礎(chǔ)上[1，8]，以石榴皮、黃芩、黃連等3種中藥和乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等2株益生菌為材料，制備復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑，在斷奶仔豬中進(jìn)行應(yīng)用研究，旨在為利用生物制劑控制豬大腸桿菌病發(fā)生、實(shí)現(xiàn)菌株耐藥性逆轉(zhuǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 益生菌、中藥 黃連、黃芪、石榴皮，購(gòu)自鄭州中藥批發(fā)市場(chǎng)；乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌，由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通肉湯、LB等培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.3 抗菌藥標(biāo)準(zhǔn)品 諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、四環(huán)素(TC)、復(fù)方新諾明(SXT)、強(qiáng)力霉素(DOX)、氨芐西林(AM)、鏈霉素(SM)等 7 種藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇生物技術(shù)有限公司；藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 主要儀器 中藥多功能提取罐：上海達(dá)程試驗(yàn)設(shè)備有限公司；BMR系列中試發(fā)酵罐(50 L)，上海傲中生物工程設(shè)備有限公司；核酸電泳系統(tǒng)：上海禾工科學(xué)儀器有限公司；Enduro GDS凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Labnet公司。

1.5 復(fù)方中藥煎劑的制備 將石榴皮、黃芩、黃連等3種中藥按劉玉慶等[9]方法，以2∶3∶5比例,采用煎煮法提取，使藥液中生藥含量均為1 g/mL，滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 復(fù)方益生菌制劑的制備 按王永芬等文獻(xiàn)[10]方法，分別制備乳酸桿菌與枯草芽孢桿菌制劑，1∶1混合制備復(fù)合益生菌制劑4℃保存。用稀釋平板法檢測(cè)產(chǎn)品活菌數(shù)(CFU/g)。

1.7 復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能與腹瀉預(yù)防效果

1.7.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選取與飼喂 選擇日齡相同、體重相近的19日齡健康三元雜交仔豬16窩，編號(hào)依次為1～16，每4窩為1組，隨機(jī)分為4組。依次為對(duì)照組（CK）、試驗(yàn)1組（復(fù)方中藥制劑組）、試驗(yàn)2組（復(fù)方益生菌制劑組）、試驗(yàn)3組（復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑組）。在常規(guī)日糧基礎(chǔ)上，各試驗(yàn)組采用濕拌料，復(fù)方中藥制劑10mL/kg、復(fù)方益生菌制劑10 g/kg，每日添加3次。添加時(shí)間為19～28日齡。對(duì)照組、試驗(yàn)組均按豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理方式飼養(yǎng)，斷奶時(shí)間為28日齡。

1.7.2 試驗(yàn)地點(diǎn)與觀察時(shí)間 試驗(yàn)在河南安陽(yáng)某豬場(chǎng)進(jìn)行，觀察時(shí)間從19日齡開(kāi)始到42日齡。

1.7.3 測(cè)定指標(biāo) 仔豬日增重、料重比、腹瀉率、腹瀉頻率和死亡率。其中腹瀉率（%）=腹瀉頭數(shù)/總頭數(shù)×100；腹瀉頻率（%）=Σ(腹瀉仔豬頭數(shù)×仔豬腹瀉天數(shù))/(供試豬總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100。血清免疫指標(biāo)測(cè)定，分別在19日齡、28日齡、35日齡和42日齡，每組隨機(jī)選取5頭仔豬采血，用IgG非特異性抗體試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 豬場(chǎng)環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥性質(zhì)粒消除與耐藥性逆轉(zhuǎn)的測(cè)定 19、28、42日齡分別在各組圈欄內(nèi)各采集5個(gè)糞樣，分離致病性大腸桿菌，進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)、耐藥性質(zhì)粒提取檢測(cè)，比較不同階段菌株耐藥性與所含質(zhì)粒數(shù)量。

1.9 豬糞中氨氣釋放量的測(cè)定 19、28、42日齡分別在各組圈欄內(nèi)各采集5個(gè)糞樣，按照李萬(wàn)軍等[11]方法測(cè)定氨氣釋放量。

1.10 數(shù)據(jù)處理 用SPSSV19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行F檢驗(yàn)，并用Duncan′s法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方益生菌制劑活菌數(shù)的檢測(cè) 經(jīng)檢測(cè)制備的乳酸桿菌益生菌制劑、枯草芽孢桿菌益生菌制劑、乳酸桿菌-枯草芽孢桿菌復(fù)合益生菌制劑中的活菌數(shù)分別為8.29×108、6.79×109、8.97×108CFU/g。

2.2 復(fù)方中藥-益生菌生物制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能與腹瀉預(yù)防效果

2.2.1 對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能與腹瀉預(yù)防的影響由表1可知，試驗(yàn)各組日增重顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），料重比、腹瀉率、腹瀉頻率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)3組日增重較試驗(yàn)1組、2組分別提高23.03%（P＜0.05）和 20.65%（P＜0.05）；料重比分別下降21.46%（P＜0.05）和18.10%（P＜0.05）；腹瀉頻率分別下降65.23%、54.12%（P＜0.05）。說(shuō)明復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的提高和腹瀉預(yù)防的效果顯著優(yōu)于中藥制劑和復(fù)方益生菌制劑組。

2.2.2 對(duì)斷奶仔豬血清中IgG含量的影響 由表2可知，隨著生物控制劑飼喂時(shí)間的增加，各試驗(yàn)組IgG含量呈上升趨勢(shì)；到42日齡時(shí)，試驗(yàn)3組IgG含量較試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組，分別提高了62.29%、17.44%（P＜0.05）。說(shuō)明復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑能較好地提高仔豬血清中IgG的含量。

表1 復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑對(duì)斷奶仔豬的影響 （Means±SD）

表2 復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑對(duì)斷奶仔豬血清中Ig G含量的影響 （Mean±SD）

2.3 豬場(chǎng)環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥性質(zhì)粒消除與耐藥性逆轉(zhuǎn)的測(cè)定

2.3.1 豬場(chǎng)環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥性質(zhì)粒消除的測(cè)定 由表3可知，分離到的豬致病性E.coli菌株都含有質(zhì)粒，但不同時(shí)間、不同試驗(yàn)組中菌株質(zhì)粒數(shù)有較大差異。隨著生物控制劑飼喂時(shí)間的增加，分離到菌株數(shù)量和菌株所含的平均質(zhì)粒數(shù)都呈下降趨勢(shì)，各試驗(yàn)組的質(zhì)粒平均消除率分別為39.22%、6.25%、46.51%。說(shuō)明復(fù)方中藥-益生菌生物制劑對(duì)豬致病性大腸桿菌具有較好的質(zhì)粒消除作用。

表3 豬場(chǎng)環(huán)境中大腸桿菌耐藥性質(zhì)粒消除的測(cè)定

2.3.2 豬場(chǎng)環(huán)境中致病性大腸桿菌耐藥性逆轉(zhuǎn)的測(cè)定 由表4可知，18日齡時(shí)各組分離到的致病性大腸桿菌對(duì)7種抗生素平均敏感率分別為7.09%、7.14%、6.96%、7.15%（P＞0.05）；經(jīng)過(guò)不同生物制劑飼喂添加后，各試驗(yàn)組平均敏感率較對(duì)照組分別提高31.65%、22.40%和57.66%。

表4 豬場(chǎng)環(huán)境中大腸桿菌耐藥性逆轉(zhuǎn)的測(cè)定

2.4 豬糞中氨氣釋放量的測(cè)定 由表5可知，復(fù)方中藥制劑、復(fù)方益生菌制劑、復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑的持續(xù)添加可以顯著降低氨氣的排放量，以復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑效果最佳，較對(duì)照組降低約50%。

表5 發(fā)酵豬糞中氨氣釋放量的測(cè)定

3 討論

3.1 豬致病性大腸桿菌耐藥性是豬大腸桿菌病防控的難點(diǎn)[12]。本試驗(yàn)在前期對(duì)87株豬致病性大腸桿菌具有質(zhì)粒消除作用的中藥篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，制備了以質(zhì)粒消除為主導(dǎo)、兼有抗菌作用的石榴皮、黃芩、黃連復(fù)方中藥質(zhì)粒消除劑；為了達(dá)到預(yù)防治療豬大腸桿菌病的目的，以前期試驗(yàn)篩選出的乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌為材料，制備復(fù)合益生菌制劑，二者協(xié)同使用，不僅提高了動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和血清中IgG含量，而且對(duì)耐藥性質(zhì)粒具有消除作用，使菌株耐藥性得以逆轉(zhuǎn)，控制了耐藥菌的產(chǎn)生。

3.2 控制和減少養(yǎng)豬生產(chǎn)中氨的釋放量，是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要。本試驗(yàn)制備的復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑，在結(jié)合中藥和益生菌分別作為綠色飼料添加劑優(yōu)勢(shì)的基礎(chǔ)上，利用中藥能為益生菌的增殖掃除障礙，益生菌可以促進(jìn)動(dòng)物體對(duì)中藥的消化吸收等協(xié)同作用效果，使飼料消化率得以大幅度提升，使豬糞中氨氣釋放量降低了約50%，對(duì)凈化豬場(chǎng)環(huán)境起到了積極的作用。

3.3 試驗(yàn)表明，中藥、益生菌的聯(lián)合使用，具有較好的協(xié)同作用，但它們之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的疊加，而是復(fù)雜的組合效應(yīng)，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本試驗(yàn)中復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑使用是針對(duì)仔豬免疫生理特點(diǎn)、斷奶應(yīng)激而初步設(shè)立的。如何改進(jìn)中藥、益生菌復(fù)配比例、添加比例、飼喂時(shí)間等，使復(fù)方中藥-益生菌生物控制劑在整個(gè)豬生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮最大效益，將是我們下一步開(kāi)展的研究工作。

[1] 王永芬，席磊，趙志軍，等.不同生物制劑對(duì)豬致病性大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(1)：60-66.

[2] 舒蕾，萬(wàn)莉，張琦，等.四川某些規(guī)?；i場(chǎng)大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（3）：32-34.

[3] RossGR，Gusils C，Gloria R，etal.Effects of probiotic adminis?tration in swine[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，109(6)：545-549.

[4] SignoriniM L，Soto L P，Zbrun M V，et al.Impact of probiotic administration on the health and fecal microbiota of young calves：A meta-analysis of randomized controlled trials of lactic acid bacteria[J].Research in Veterinary Science，2012，93(1)：250-258.

[5] 陸銀，武旭峰，費(fèi)擁軍，等.復(fù)合益生菌對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能及屠體品質(zhì)的影響[J].中國(guó)畜牧雜志，2013，49(1)：51-53.

[6] 肖莉春，孔祥峰，郭小權(quán).中藥抑菌成分及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用前景[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24(12)：2311-2318.

[7] 沈永恕，張春輝，荊新蕊，等.大腸埃希氏細(xì)菌中ESBLs耐藥質(zhì)粒的傳播與消除研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，38(2)：41-46.

[8] 王永芬，席磊，邊傳周，等.豬致病性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒檢測(cè)及其中藥消除作用研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33(12)：932-935.

[9] 劉玉慶，李曄，車程川，等.大腸桿菌對(duì)中草藥敏感性試驗(yàn)及其方法研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003，22(1)：3-5.

[10] 王永芬，趙志軍，席磊，等.單一菌種與復(fù)合菌種益生菌制劑對(duì)蛋雞生產(chǎn)效果研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(11)：28-31.

[11] 李萬(wàn)軍，張德威.益生菌對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能及雞舍空氣環(huán)境的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，2：71-72.

[12] 蘇海峰，蔣月，徐國(guó)鋒，等.哈爾濱周邊地區(qū)豬源致病性大腸桿菌耐藥性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48(6)：46-49.