楊應(yīng)華，劉小萍，鐘友剛，施振聲

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

犬精液冷凍技術(shù)能顯著提高犬繁育效率，在歐美等國家已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用。雖然目前世界上沒有一個統(tǒng)一的冷凍操作規(guī)范，但仍然存在著一些操作慣例。比如人們總是盡快將采集的新鮮精液進入冷凍程序，因為在體外犬精液的質(zhì)量會隨時間延長而出現(xiàn)下降。然而在實際操作過程中，從精液采集成功到精液進入冷凍操作程序之間的這段時間是不可避免的。首先精液質(zhì)量的評估需要一段時間，其次一些冷凍實驗室與精液采集地可能距離較遠，這也會耽誤一定時間。為了探究延遲時間對冷凍效果的影響程度及確定一個可接受的時間范圍，本研究調(diào)查了犬新鮮精液在常溫下不同的保存時間對精液冷凍效果的影響，以期為實際操作規(guī)范的制定提供參考。

1 材料

1.1 試驗動物 共5只公犬（3只中型雜種犬，1只比格犬，1只薩摩耶犬），年齡2～5歲，體況良好，均來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。飼喂全價日糧，不限飲水，每日遛1～2次。

1.2 試驗試劑 三羥甲基氨基甲烷（Tris）、一水檸檬酸、果糖、甘油、青霉素、鏈霉素、蛋黃、Equex STM paste（Nova ChemicalSales，Scituate Inc.，MA，USA）、臺盼藍染色液、吉姆薩染色液、中性紅、甲醛等。

1.3 主要儀器 日本Olympus公司CX41型相差顯微鏡；以色列Sefi MedicalInstruments公司Makler細胞計數(shù)板；德國Minitube公司，0.5 mL細管、液氮罐；澳大利亞Cryologic公司，CL-3300程序控溫儀；日本視科特，JL-3001D攝像機等。

2 方法

2.1 精液采集 手握法采集富含精液段和部分前列腺液段精液，用集精漏斗收集至15 mL離心管中。每次試驗共采集5只犬精液，由2人共同完成。試驗重復(fù)3次，每次試驗間隔3 d。

2.2 精液質(zhì)量評估

2.2.1 密度 將少量精液用蒸餾水稀釋10倍，放置1 min后精子即失去活力，之后移液器吸取10μL于Makler細胞計數(shù)板進行計數(shù)。

2.2.2 活力 電腦輔助的主觀測量。根據(jù)精液密度將精液用生理鹽水適當稀釋，之后用Makler細胞計數(shù)板在相差顯微鏡20倍物鏡下觀察，配合使用帶有錄制和回放功能的攝像軟件進行活力的主觀測量。每個樣品鏡下隨機檢查5個視野，統(tǒng)計精子總數(shù)不少于200個。

精子活力＝直線前行精子數(shù)／總精子數(shù)×100%

2.2.3 質(zhì)膜完整率 采用低滲透壓法（Hypo-osmotic test）進行測量。配置含75 mmol／L果糖和25 mmol／L檸檬酸的低滲透壓水溶液（100 mOsmol／L）。取20μL精液用低滲液稀釋至200μL，在37℃水浴中放置1 h后在相差顯微鏡40倍物鏡下觀察。

質(zhì)膜完整的精子會出現(xiàn)尾部蜷曲，而質(zhì)膜不完整的精子形態(tài)不發(fā)生變化。前者所占比例即為質(zhì)膜完整率。

圖1 犬精子在低滲液中的相差顯微鏡下觀察 （400×）

2.2.4 頂體完整率 采用改良的臺盼藍-吉姆薩復(fù)染色法進行測量[1]。取50μL精液與等體積0.2%臺盼藍混合，置于37℃水浴中5 min，制作涂片后用福爾馬林-中性紅溶液固定2 min，然后將風(fēng)干玻片在37℃溫箱中用7.5%吉姆薩染液染色3 h，最后沖洗玻片，待風(fēng)干后油鏡下檢查。

臺盼藍染色可鑒別精子死活，吉姆薩染色可區(qū)分頂體完整與否，所以該復(fù)染色法能同時鑒別精子的死活和頂體完整率。頂體完整率＝頂體完整的活精子／精子總數(shù)

2.3 精液混合，分組 將質(zhì)量合格的精液（活力＞80%）混合均勻，平均分為3份，分別標記為對照組、0.5 h組和1 h組。對照組立即進入冷凍階段，30 min后0.5 h組進入冷凍階段，再過30 min后1 h組進入冷凍階段。各組進入冷凍階段前進行精子質(zhì)量評估。

2.4 精液冷凍 冷凍稀釋液及冷凍步驟大致遵循Linde Forsberg的方法[2]，使用程序溫控儀進行降溫。冷凍程序簡述如下：700 r／min離心5 min，去除上清液，用稀釋液1稀釋精液至4億個／mL濃度，將精液置于含室溫水的燒杯中后再放入冰箱平衡1.5 h至5℃，再逐滴加入與稀釋液1等體積的稀釋液2，最后再置于冰箱20 min。將精液用吸液器裝入0.5 mL細管后熱封，再插入程序溫控儀降溫（降溫速率：5℃-20℃-80℃），最后在液氮罐中長期保存。

2.5 精液解凍和質(zhì)量評估 精液冷凍保存至少1個月后，將液氮中的細管迅速浸沒于37℃水浴中不斷搖動。1 min后將凍融精子加入37℃的1 mL解凍液中混勻。在解凍5 min后對精液的活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率進行評估。。

圖2 犬新鮮精液常溫保存不同時間對冷凍前后精液質(zhì)量的影響

表1 稀釋液及解凍液配方（100 mL體系）

2.6 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件（17.0.0版本SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）單因素方差分析中的最小差異性顯著法（LSD，Least Significant Difference）進行方差分析，當P＜0.05時認為有顯著差異。

3 結(jié)果

剛采集的精液平均密度為1.2億／mL，活力86.33%，冷凍前后精液質(zhì)量見表2和圖1

3.1 活力 冷凍前0.5 h組活力與對照組無顯著差異，但1 h組活力與對照組差異顯著（P＜0.05）；解凍后，所有組精子活力都顯著低于冷凍前。對照組，0.5 h組和1 h組精子活力依次降低，但只有1 h組活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

3.2 質(zhì)膜完整率 冷凍前，0.5 h組與對照組無顯著差異，但1 h組活力與對照組相比有顯著下降（P＜0.05）；解凍后，同凍前相比所有組精子的質(zhì)膜完整率都顯著下降，但各組見無顯著差異（P＞0.05）。

3.3 頂體完整率 冷凍前各組間無顯著差異（P＞0.05），解凍后所有3組的頂體完整率都顯著下降，但各組間仍無顯著差異（P＞0.05）。

4 分析與討論

本研究調(diào)查了犬新鮮精液在常溫下的保存時間對冷凍效果的影響。犬新鮮精液在體外常溫條件下保存時間非常有限，因為精液中的主要液體成分是前列腺液，其營養(yǎng)、pH值等條件并不適合精液的長期保存。England等證明，如果將犬精子與其自身的前列腺液混合培養(yǎng)，精子質(zhì)量會下降得更快[3]。Hermansson也發(fā)現(xiàn)，即使將新鮮精液置于4℃保存，精子活力在第1天就會顯著下降，到第2天精子活力全部喪失[4]。本研究的結(jié)果與前人的發(fā)現(xiàn)一致，常溫保存1 h就會使新鮮精液的活力和質(zhì)膜完整率出現(xiàn)顯著的下降。

由于不可避免的冷凍損傷，解凍后精液的各項指標都顯著下降。對照組解凍后的活力（40.92%）還不是很理想，這可能與冷凍前精液活力（86.33%）不是非常高及冷凍過程中一些人為操作有關(guān)。對照組的活力顯著高于1 h組而與0.5 h組無顯著差異，這說明新鮮精液常溫保存0.5 h還不足以顯著影響解凍后精子活力，而保存1 h則會產(chǎn)生顯著的影響?？紤]到冷凍前后對照組和0.5 h組的活力（凍前分別：86.33%和87.67%；凍后分別：40.92%和34.58%）差距有所增大，說明新鮮精液常溫保存0.5 h也對解凍后精液的品質(zhì)造成了一定的不利影響。解凍后質(zhì)膜和頂體完整率在各組間都無顯著影響，表明這兩個形態(tài)學(xué)指標對試驗中采用的常溫保存時間（0.5 h或1 h）沒有比活力指標對保存時間那么敏感，推測更長的保存時間才能造成顯著的形態(tài)學(xué)變化。

表2 犬新鮮精液常溫保存不同時間對冷凍前與解凍后的精子質(zhì)量的影響

犬精液冷凍的實際生產(chǎn)實踐中，精液采集與冷凍實驗室不在同一地情況時有發(fā)生。這種情況下，如果兩地距離間隔比較遠，可以將鮮精用專門的稀釋液稀釋后冷藏保存，保存時間在2 d以內(nèi)不會影響冷凍效果[5]。本研究結(jié)果表明，如果兩地距離很近（半小時車程內(nèi)），就可以免去運送犬只、配置稀釋液及冷藏操作等麻煩，可直接在室溫下將精液送至實驗室冷凍，而不至于對冷凍效果產(chǎn)生顯著的不利影響。本研究選用的鮮精保存條件是便于實際操作的室溫（23℃），因為犬精子相較于其他動物的精子更能耐受低溫[6]，而精子在低溫時活動代謝減緩，據(jù)此推斷在更低保存溫度下（如15℃或4℃等），精子質(zhì)量下降速度可能更慢，但尚需進一步試驗研究證實。

5 結(jié)語

犬新鮮精液在常溫下保存0.5 h不會對凍融精液的活力、質(zhì)膜和頂體完整率造成顯著影響；而保存1 h可顯著降低凍融精液的活力，但質(zhì)膜和頂體完整率不受影響。所以在犬精液冷凍的實際操作中，為了獲得最好的冷凍效果，精液采集后應(yīng)在30分鐘內(nèi)進入冷凍程序。

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