趙曉彤，吳運譜，薛樹山，石 霖，曹明慧，顧貴波，谷志大，魏 澍，何 欣，王宏燕，閆海濱，于長泳，曹 東

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動物醫(yī)學研究院，遼寧 沈陽 110164；3.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081）

新城疫(ND)是由新城疫病毒（NDV）所引起的禽類一種急性、烈性傳染病，其主要侵害雞和火雞，發(fā)病率和死亡率均非常高，為危害我國養(yǎng)禽業(yè)的最嚴重疾病之一[1]，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，為國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）所規(guī)定的5種優(yōu)先防治的一類動物疫病之一。

依據(jù)基因組長度不同，NDV分為Class I和Class II兩大譜系[1]，Class I型的基因組長度為15198nt，Class II中I-IV型和V-IX型NDV分別為15186nt和15192nt。NDV雖只有一個血清型，但其毒株眾多且毒力差別較大[1-3]，給ND的防制帶來極大困難。NDV為單股不分節(jié)段負鏈RNA病毒，病毒基因組結(jié)構(gòu)模式為3'-NPP-M-F-HN-L-5'，其囊膜表面糖蛋白-融合蛋白（F）介導病毒囊膜與靶細胞膜融合，促使病毒基因組進入胞槳[4]，為決定NDV毒力的主要因素之一。血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN)能夠識別靶細胞的唾液酸受體，介導病毒粒子對靶細胞的吸附，促使新生病毒粒子從感染細胞膜表面釋放，并促進融合蛋白的融合功能[5]。因此對遼寧NDV分離株的F、HN基因進化規(guī)律的研究，可為本省制定新城疫防制對策提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SPF雞胚 9-11日齡SPF雞胚購自遼寧省益康生物股份有限公司。

1.2 主要試劑 NDV標準抗原及標準陽性血清、H5、H7、H9亞型禽流感標準陽性血清，購自哈爾濱維科公司；EDS76血凝抗原和HI試驗陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；NDV核酸熒光RT-PCR試劑盒，購自深圳匹基公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。TRIZol LS、DTT、RNaseOUT、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（MLV），購自Invitrogen公司。

1.3 引物設計 參照文獻[7]設計合成F基因引物，上游引物為F1：5'-ATGGGCTCCAAACCTTC?TAC-3'；下游引物F2：5'-TTGTAGTGGCTCTCATC-3'，F(xiàn)基因預期片段大小為1700 bp。參照文獻[8]設計合成HN基因引物，上游引物HN1:5'-GAT?CAGATGAGAGCCACTA CAA-3'；下游引物 HN2：5'-GATAGATGTGACTCTGGTAGGAT-3'。HN基因預期片段大小為2267 bp。新城疫通用反轉(zhuǎn)錄引物：5'-ACGGGTAG AA-3'。

1.4 病毒的檢測鑒定 病料來源于本中心對遼寧省禽屠宰場的例行監(jiān)測任務。研磨樣品并提取核酸，應用NDV核酸熒光RT-PCR試劑盒檢測。將4份陽性病料研磨液接種SPF雞胚，收集尿囊液[8]，按照ND診斷技術標準進行HA和HI試驗[9]，尿囊液均能被ND標準血清抑制，但不能被H5、H7、H9亞型AIV標準血清和EDS-76血清抑制，分別命名為 CK/CY1/2013、CK/DD2/2013、CK/YK1/2013、CK/TL4/2013，分別簡稱為CY1株、DD2株、YK1株和TL4株。

1.5 F基因和HN基因的擴增及序列測定 取各分離株的尿囊液200μL，按照Invitrogen公司TRIZol說明書操作，提取RNA。反轉(zhuǎn)錄反應體系：RNA懸液2μL，20 pmolRT反應引物2μL，混勻，70℃水浴5 min后立即冰浴3 min，依次加入dNTP（2.5 mmol/μL）4μL，0.1mol/L DTT 4μL，M-MLV 1μL（10 U），RNA酶抑制劑1μL（20 U），5×反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8μL混合均勻后。37℃水浴3 h。所獲得cDNA用于F、HN基因片段擴增，PCR擴增體系：2.5μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液，0.5μL dNTPs，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U)，上、下游引物各0.5 μL，1.5μL cDNA，加滅菌超純水至25μL。PCR反應條件:95℃5 min；94℃2 min、53℃1 min、72℃2 min，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。陽性PCR產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.6 F基因、HN基因系統(tǒng)進化樹及序列相似性分析 用Lasergene7.0的MegAlign對從GenBank下載32株NDV的F基因序列和19株NDV的HN基因序列進行序列分析。

1.7 致死雞胚平均時間（MDT）測定 按照《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準(二〇〇一年版)[10]規(guī)定執(zhí)行。

1.8 F基因的生物信息學分析 利用Lasergene 7.0軟件和ExPASy服務器上的Prot Param軟件（http://web.expasy.org/protparam/），分析NDV F基因的分子理化性質(zhì)；利用TMHMM Server v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析F蛋白的序列跨膜區(qū)；利用SignalP 4.1軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測分析F蛋白的信號肽[11]。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測及鑒定結(jié)果 所接SPF雞胚均在72 h以內(nèi)死亡，死亡雞胚全身水腫、充血。收獲尿囊液進行HA和HI試驗。HA和HI試驗結(jié)果表明，4個分離株的尿囊液均可凝集雞紅細胞，HA凝集效價均在27以上，不能被禽流感陽性血清所抑制，初步判定為NDV。ND病毒核酸熒光RT-PCR檢測均為陽性，采用F、HN基因PCR引物均能擴增出相應條帶。

2.2 F基因系統(tǒng)進化樹及序列相似性分析結(jié)果 應用Lasergene 7.0軟件的MegAlign軟件Clust?al W方法構(gòu)建NDV F基因的系統(tǒng)發(fā)生樹，將NDV劃分為9個基因型 (圖1)。DD2株、YK1株和TL4株的F0蛋白裂解位點序列均為112GRQGRL117,具有弱毒株裂解位點特征[12]。CY1株的F0蛋白裂解位點序列為112RRQKRF117，具有強毒株裂解位點特征[12]。

核苷酸同源性分析結(jié)果表明，4個分離株的F基因與基因Ⅰ型代表株Queensland V4、Ⅱ型代表株LaSota、Ⅲ型代表株Mukteswar及Ⅸ型標準強毒F48E9的F基因的同源性分別為96.6%～97.3%、95.9%～99.9%、95.8%～96.2%、96.6%～97.1%。CY1株與基因Ⅶ型代表毒株js02株F基因的核苷酸同源性最高，為98.9%；與疫苗株LaSota核苷酸同源性為95.9%；與疫苗株Queensland V4間的核苷酸同源性96.6%。DD2株、YK1株和TL4株與LaSota株核苷酸同源性均為99.9%，與Queensland V4株核苷酸同源性分別為96.6%、97.3%、97.3%。

圖1 不同ND V毒株F基因進化樹

2.3 HN基因系統(tǒng)進化樹及序列相似性分析結(jié)果 以HN基因序列繪制的進化樹顯示，將NDV劃分為9個基因型(圖2)。4個分離株的HN基因之間，DD2株和TL4株間同源性最高，為97.5%；DD2株與CY1株間同源性最低，僅為89%。分離株CY1株與Ⅶ型js02株親緣關系最近，HN基因同源性為 99.5%；CY1 株與 F48E9、Mukteswar、LaSota、Queensland V4間HN基因的核苷酸同源性分別為94.4%、90.6%、89.0%、83.7%。分離株DD2株、YK1株和TL4株與LaSota株HN基因之間同源性分別為99.9%、96.8%、97.5%；與Queensland V4株HN基因同源性均為92.2%、89.1%、95.1%；與Mukteswar株HN基因之間同源性分別為92.8%、89.7%、91.7%；與F48E9株HN基因之間同源性分別為91.9%、88.7%、94.4%。

圖2 不同ND V毒株HN基因進化樹

表1 4個ND V分離株的F蛋白生物信息學分析

2.4 致死雞胚平均時間(MDT)測定結(jié)果 CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的MDT分別為50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h。

2.5 4個NDV分離株的F基因生物信息學分析結(jié)果 采用Prot Param軟件分析各分離株F基因的理化性質(zhì)，結(jié)果如表1。應用TMHMM Server V2.0軟件預測分析表明，各分離株F蛋白質(zhì)序列均存在2個跨膜區(qū)。Signal P軟件預測分析表明，各分離株F蛋白第1～31為氨基酸殘基為信號肽，第32為氨基酸殘基的綜合剪切位點分值最高，據(jù)此推斷各分離株F蛋白均含有信號肽，均為分泌性蛋白，最大可能剪切位點在第31～32位氨基酸之間。

3 討論

F蛋白裂解位點是NDV毒力的主要決定因素，但因長期大劑量、高頻次ND疫苗免疫所形成的高免疫壓力及RNA病毒自身易變異特性，NDV易發(fā)生點突變，因此，NDV的分子流行病學研究首選對F基因進行分析，亦有大量研究對HN基因進行分析。在本研究中，采用HN基因序列進行基因型劃分的結(jié)果(圖2)，與采用F基因序列進行基因型劃分的結(jié)果相同（圖1），這也與相關研究結(jié)果相似[7]。通過裂解位點分析及與疫苗株LaSota、Queensland V4間親緣關系分析，表明DD2株、YK1株和TL4株屬于基因Ⅱ型，與LaSota株的親緣關系最近，與Queensland V4株親緣關系均較遠，這可能與LaSota株疫苗普遍使用有關，但是否為疫苗突變株值得進一步研究。而CY1株屬于Ⅶ型，與目前在養(yǎng)禽業(yè)中流行的Ⅶ型js02株的親緣關系非常近，與LaSota、Queensland V4親緣關系均較遠。

根據(jù)毒力不同，NDV可分為強毒株、中強毒株及弱毒株3類；依據(jù)獸用生物制品規(guī)程規(guī)定，MDT小于60 h為強毒,在60～90 h為中強毒，大于90 h為弱毒；依據(jù)致病性分子基礎的F蛋白裂解位點的不同進行分類，中強毒株、強毒株裂解位點氨基酸序列多為112R/K-R-Q/K-K/R-R-F117，弱毒株裂解位點氨基酸序列則多為112G/E-K/R-Q-G/E-RL117[12]。CY1株的F蛋白裂解位點及其MDT，表明其具有強毒株的特征，同時CY1株相關特性與從本省分離到的3個Ⅶ型毒株強毒株阜新株、沙河株、盤錦株的特性相似[13]，DD2株、YK1株和TL4株的MDT均在60～90 h，可歸類于中等毒力范圍內(nèi)，裂解位點具有非強毒株的特征，因此還需要進行4個分離株的ICPI和IVPI試驗以進一步研究。鑒于F蛋白可介導病毒囊膜與靶細胞膜的融合，促使病毒基因組進入胞漿，為感染性病毒粒子侵入宿主細胞的必需結(jié)構(gòu)，因此本研究采用生物信息學技術對理化性質(zhì)、跨膜區(qū)及信號肽進行初步分析，為進一步研究奠定基礎。

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