閻 旭，韋 莉，王 菁，朱姍姍，張春燕，柳舒航，全 榮，李子璇，劉 浩，劉 爵

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 塘沽 300457；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097）

禽偏肺病毒病(Avian metapneumovirus，aMPV)是指由偏禽肺病毒引起的一種以禽呼吸道癥狀、頭部腫脹和產(chǎn)蛋率下降為主要特征的疾病。禽偏肺病毒又稱火雞鼻氣管炎病毒(TRTV)，感染火雞后可引起溫和或中度上呼吸道感染-火雞鼻氣管炎(TRT)；也可引起雞的溫和型上呼吸道或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病-腫頭綜合征(SHS)。禽偏肺病毒屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬，于1978年首次發(fā)現(xiàn)于南非共和國(guó),隨后從法國(guó)、英國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣、日本等國(guó)家和地區(qū)的呼吸道疾病或SHS發(fā)病雞中分離到aMPV。1998年沈瑞忠[1]等人在我國(guó)黑龍江某肉雞場(chǎng)的SHS雞群中分離到了APV/Chick?en/China/1/98株。

1997年，在美國(guó)科羅拉多州首次分離到與歐洲等一些國(guó)家報(bào)道的毒株不同的aMPV，命名為aMPVC。根據(jù)吸附糖蛋白G蛋白核苷酸序列分析和單克隆抗體中和試驗(yàn)，aMPV分為A、B、C、D四個(gè)亞型。aMPV-A和aMPV-B主要分布在歐洲和南非，aMPVC感染以美國(guó)為主，aMPV-D僅在法國(guó)可檢測(cè)到。通過特異性單克隆抗體中和試驗(yàn)檢測(cè)表明，aMPV-C與aMPV-A、aMPV-B之間沒有明顯的血清學(xué)關(guān)系。一般情況下，aMPV-A和aMPV-B之間蛋白結(jié)構(gòu)的同源性為70%～90%，二者與aMPV-C之間的同源性則為40%～70%，而aMPV-C與hMPV之間的蛋白結(jié)構(gòu)比其他亞型更相似。

禽偏肺病毒是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒粒子具有多形性，一般呈橢圓形，偶爾也有圓形或長(zhǎng)線狀形，直徑80～300 nm，核衣殼大小約為15 nm，有囊膜，表面纖突長(zhǎng)約13～15 nm[2]。aMPV共有8種結(jié)構(gòu)蛋白，3種膜蛋白[3-5]，即融合蛋白F、小疏水蛋白SH和糖蛋白G，其中F蛋白誘導(dǎo)與病毒包膜與宿主細(xì)胞質(zhì)膜的融合，又稱為融合蛋白。病毒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜的融合是把核衣殼傳遞到細(xì)胞質(zhì)中，隨后感染細(xì)胞，在感染的細(xì)胞質(zhì)膜中表達(dá)的F蛋白可以介導(dǎo)與鄰近細(xì)胞質(zhì)融合形成合胞體[6-7]，合胞體可能是病毒傳播的機(jī)制。F蛋白為I型膜蛋白，編碼540～580個(gè)氨基酸，研究表明，F(xiàn)蛋白是偏肺病毒宿主嗜性的主要決定因素[14]。本試驗(yàn)的目的是利用可溶性的大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)aMPV F基因，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種、酶類及其他試劑 Pcmv-myc-L質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室保存；pBCX載體謝青梅博士惠贈(zèng)。基因工程宿主菌E.coli DH5α，TaKaRa公司購(gòu)買；表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）博邁德生物公司購(gòu)買。PrimeSTAR HS DNA Polymerase，購(gòu)自 TaKaRa公司；Trans2K DNA Marker，購(gòu)自Transgen公司；快速凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Kpn I和磷酸酶抑制劑，購(gòu)自NEB公司；QIAquick PCR Purification Kit，購(gòu)自Qiagen公司；T4 DNA連接酶，購(gòu)自Fermentas公司；IPTG、Amp、溴化乙錠（EB），購(gòu)自寶泰克生物科技有限公司；6×His-Tag融合蛋白親和層析Ni-NTA凝膠，購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.2 F基因的擴(kuò)增、回收 根據(jù)GenBank上發(fā)表的A型aMPV F蛋白基因序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(F1/F2)，F(xiàn)1：5′-GG GGTACC GAG?GCAGTATCCACATTAGGG-3′，F(xiàn)2：5′-CCC AAGCTT CTTGGCATCTGCACCTAG-3′。其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1023 bp，以Pcmy-myc-L作為模板取0.2μL，加入上下游引物F1、F2各1μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，5×Buffer4μL，Prime STAR 0.2μL，加ddH20至20μL。PCR反應(yīng)循環(huán)程序如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，59℃1.5 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，OMEGA公司快速凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 回收的F基因經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切，克隆至pBCX載體中，構(gòu)建pBCX/AMV/A/F。將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21（DE3）中，鑒定為陽性的單菌落，加入終濃度分別為0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定最適誘導(dǎo)條件。

1.4 目的蛋白的可溶性分析、純化及鑒定 參照確定的最適誘導(dǎo)條件，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體冰浴條件下超聲破碎，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。按照Qiagen純化蛋白試劑盒說明，在非變性的條件下，將1000 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后的菌液，取菌體裂解、離心，將上清通過Ni-NTA柱，收集洗脫液，并測(cè)蛋白濃度。將純化所得蛋白分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳和WB。常規(guī)制備樣品，12%SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉NC膜，PBST洗膜3次，加入1∶800稀釋的一抗溶液，室溫孵育2 h，PBST液洗膜3次，放人1∶8000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗中，室溫孵育1.5 h，PBST液洗膜3次，每次10 min。把NC膜浸入到配好的底物溶液中顯色，出現(xiàn)顏色時(shí)，立刻用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，拍照。

2 結(jié)果

2.1 F基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 用所設(shè)計(jì)的F1/F2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從Pcmy-myc-L質(zhì)粒中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，可以見到長(zhǎng)約1023 bp左右的電泳條帶，大小與預(yù)期的相吻合（圖1）。

圖1 F基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒的酶切與PCR鑒定結(jié)果 挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增到長(zhǎng)約1023 bp的片段（圖2）。aMPV-F基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化酶切后，插入pBCX載體的外源基因插入位點(diǎn)，構(gòu)成重組質(zhì)粒pBCX-F（圖3）。

圖2 單菌落PC R鑒定

圖3 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 SDS-PAGE分析結(jié)果 取菌液接種到LA液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min離心振搖培養(yǎng)，待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600為0.4～0.5時(shí)加入IPTG并使其終濃度達(dá)1 mmol/mL，取不同小時(shí)誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物如圖4所示，直接將融合蛋白細(xì)菌裂解上清用QIAGEN NI純化柱純化，在Clution Buffer洗脫液中含有目的融合蛋白，如圖5所示。

圖4 融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的S D S-PA G E檢測(cè)

圖5 融合蛋白純化S D S檢測(cè)

圖6 表達(dá)重組蛋白的W estern-blotting鑒定

2.4 Western-blotting分析結(jié)果 經(jīng)SDS-PAGE電泳，利用Western-blotting對(duì)純化的aMPV F融合蛋白進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果在預(yù)定的74 kDa上方處有一條較深的顯色帶，說明重組F蛋白具有抗原活性，大小與SDS-PAGE表達(dá)的蛋白大小一致。該結(jié)果證實(shí)了用載體pBCX表達(dá)的融合蛋白F均具有免疫活性。

3 討論

目前我國(guó)是世界上第一養(yǎng)雞大國(guó)，雞的飼養(yǎng)量96億只，每年因各類禽病帶來的死亡率高達(dá)20%～25%，損失數(shù)百億人民幣。因此，研制特異、靈敏、簡(jiǎn)便的診斷試劑盒是我國(guó)當(dāng)前防控疫病的迫切需求。在眾多的表達(dá)系統(tǒng)之中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)進(jìn)行了A型aMPV F基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)，所選取的表達(dá)載體pBCX是pet-43.1載體插入了msyB基因作為融合伴侶的改造載體，msyB基因編碼蛋白是大腸桿菌本身的蛋白，是一種高可溶性多肽，本身在大腸桿菌中表達(dá)量很高，其作為載體蛋白具有穩(wěn)定性、可溶性和表達(dá)水平高的特性；pBCX載體有6×His融合標(biāo)簽，有腸激酶的裂解位點(diǎn)，便于檢測(cè)和純化所表達(dá)的重組融合蛋白，本試驗(yàn)表達(dá)的F蛋白具有免疫原性，可以直接作為免疫原免疫動(dòng)物，也可以純化之后免疫動(dòng)物，或與佐劑配合之后免疫動(dòng)物。為了減少免疫的副作用，也可以用腸激酶處理該融合蛋白，將目標(biāo)蛋白與伴侶蛋白裂解，收集、純化目標(biāo)蛋白，用目標(biāo)蛋白作為抗原免疫動(dòng)物。

本試驗(yàn)僅是初步探索了aMPV F基因在大腸桿菌中的表達(dá)情況，為更加深入地研究aMPV F基因的功能及其他重組蛋白的表達(dá)提供了參考，aMPV F基因在大腸桿菌中的成功表達(dá)為aMPV診斷抗原及基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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