夏忠勝， 鐘 娃， 于 濤， 練國達， 周慧敏， 陳廣成

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內科，廣東 廣州 510120)

結腸癌是西方國家最常見的胃腸道惡性腫瘤，是導致腫瘤患者死亡的第二常見原因。在過去的20年，結腸癌的發(fā)病率在中國一直不斷增長。結腸癌、肺癌及乳腺癌成為近20年中國增長最快的3種惡性腫瘤。因此，結腸癌已成為越來越嚴重的社會健康問題。大多數(shù)結腸癌患者診斷時已是中晚期，因此，單純靠外科手術不能完全治愈這些患者，必須同時輔以化療或放療等治療方法。因此，化療在中晚期結腸癌患者治療中仍具有非常重要的作用。但迄今為止，大多數(shù)結腸癌患者對化療藥物反應有限，即使是最佳的聯(lián)合化療方案，也只有不到50%的結腸癌患者有效。而且，在這些不到50%有效的結腸癌患者中，化療緩解后停藥一段時間又會復發(fā)[1]。導致這些現(xiàn)象的根本原因就在于結腸癌細胞獲得了多藥耐藥性(multidrug resistance, MDR)。

導致腫瘤細胞耐藥的傳統(tǒng)經(jīng)典機制包括腫瘤細胞表達P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)或肺癌耐藥蛋白(lung cancer resistance protein, LRP)等膜蛋白[2]，這些跨膜蛋白能將化療藥物泵出細胞外，從而使腫瘤細胞內化療藥物濃度降低，導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗。針對這些蛋白的MDR逆轉劑，包括鈣拮抗劑、反義核酸、小干擾RNA[3]等，在體外實驗中雖然能逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性，但在體內特別是在人體，與化療藥聯(lián)用并不能改善腫瘤患者的預后。

近年來腫瘤干細胞概念的出現(xiàn)為解釋上述現(xiàn)象提供了一種新的思路。目前認為腫瘤干細胞在腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥性過程中起到非常重要的作用。為了靶向殺滅腫瘤干細胞，人們一直在努力尋找腫瘤干細胞的特異標記。CD133、CD44 等曾被認為是包括結腸癌在內的腫瘤干細胞的特異標志[4]，但有學者發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤中，CD133陰性的腫瘤細胞亦具有腫瘤干細胞特性[5]，因此CD133是否能作為腫瘤干細胞的特異標志物及腫瘤細胞多藥耐藥的靶點仍存有爭議。

腫瘤細胞中的側群(side population，SP)細胞現(xiàn)已被公認為具有腫瘤干細胞樣特性，其具有自我更新及分化的特點，并對多種化療藥物耐藥[6]。SP細胞通常會表達MDR1、BCRP1或ABCG2等膜蛋白。但同時也有研究指出, 在多種非SP 細胞中也有一定程度的BCRP1表達, 提示這些轉運蛋白對SP 細胞的表型有作用, 但并不是特異的標志物[7]。Behbod等[8]曾探討過乳腺癌SP細胞的基因標志，但目前尚未見有關探討結腸癌SP細胞與非SP細胞在microRNA表達譜方面差異的報道。本文通過比較幾種結腸癌細胞系中SP細胞與非SP細胞microRNA表達譜的差異，探討結腸癌SP細胞的microRNA標志物，為結腸癌SP細胞的靶向治療尋找新的特異靶點。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)液、Hoechst 33342、MTT和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自Sigma-Aldrich；胎牛血清及RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；草酸鉑(oxaliplatin)購自Sanofi-Synthelabo；阿霉素(adriamycin)購自Pharmacia & Upjohn；miRNeasy Mini Kit 購自Qiagen；microRNA芯片采用Exiqon的miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0)；逆轉錄試劑盒由上?？党缮锛夹g公司提供；PCR擴增儀采用Applied Biosystems的GeneAmp? PCR System 9700；流式細胞儀為BD Biosciences產(chǎn)品。

2 細胞培養(yǎng)

結腸癌細胞系HCT-15、HT-29及LoVo均購自中國科學院上海細胞庫。3種細胞株均采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3 主要方法

3.1SP細胞的分選 參照文獻[9]的方法，并進行部分改良。培養(yǎng)的細胞用胰酶消化處理后再用PBS洗滌，然后用含5%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃重新混懸細胞。預孵育10 min后，采用5 mg/L Hoechst 33342染料標記細胞90 min(加或不加維拉帕米；維拉帕米是ATP結合轉運蛋白的抑制劑，工作濃度為50 μmol/L)。采用1 mg/L碘化丙啶標記死亡細胞進行對比染色。接下來，每組細胞采用BD FACSAia II熒光激活細胞分選系統(tǒng)對1×106活細胞進行分析及分選。Hoechst 33342染料的激發(fā)波長為355 nm，其熒光強度采用雙波長濾光鏡(分別為450 nm的Hoechst藍和635 nm的Hoechst紅)檢測。通過630/BP30濾光鏡測量碘化丙啶標記從而將死亡細胞區(qū)分開來。

3.2IC50測定 細胞活力的測定采用MTT法，細胞接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為1×104，生長24 h 后加入抗腫瘤藥。用倍比稀釋濃度的5-氟尿嘧啶(2～256 mg/L)、草酸鉑(0.5～64 mg/L)及阿霉素(1～128 mg/L)分別處理結腸癌HCT-15、HT-29及LoVo細胞。細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育72 h后每孔加30 μL 5 g/L MTT，37 ℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，在Synergy HT酶聯(lián)儀上以570 nm波長讀取吸光度(A)。未經(jīng)任何處理的對照組細胞活力設為100%，通過與對照組比較計算其它各組細胞活力。根據(jù)各細胞系不同濃度抗腫瘤藥處理3 d 時的A值，計算各細胞系各抗腫瘤藥3 d 的IC50。

3.3MicroRNA芯片分析 MicroRNA芯片分析由上?？党缮锛夹g公司完成。(1)RNA的提取：總RNA的分離采用Invitrogen的TRIzol試劑和Qiagen的miRNeasy Mini Kit試劑盒，具體方法參照廠家的說明書進行，其中miRNeasy Mini Kit試劑盒能有效地恢復所有種類的RNA，包括miRNAs。RNA的定性及定量檢測采用Nanodrop Technologies的ND-1000光譜儀。采用凝膠電泳檢測RNA的完整性。(2)RNA標記和雜交：從樣本分離得到RNA后，采用Exiqon的miRCURY LNATMmicroRNA Hy3/Hy5 Power Labeling Kit標記試劑盒進行miRNA的標記。RNeasy Mini Kit(Qiagen)濃縮標記樣品, 然后應用miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0) (Exiqon)和Hybridization System (Nimblegen Systems Inc.)進行芯片雜交。 具體步驟按各試劑說明書進行。(3)數(shù)據(jù)分析：雜交后芯片用Axon GenePix 4000B Microarray Scanner (Axon)進行圖像掃描, 所得數(shù)據(jù)使用GenePix Pro 6.0軟件(Axon)分析。每個樣本重復檢測4次，各樣本microRNA芯片分析的重復性檢測采用相關性分析，計算相關系數(shù)R。通過原始值減去背景值來做修正, 并用中值做標準化，分別計算出每組2個樣本中miRNA的標準值及比值，以比值差異大于或等于2為差異有顯著性。

3.4MicroRNA表達的RT-PCR驗證 實時熒光定量PCR檢測目的miRNA表達量：根據(jù)microRNA芯片分析結果，挑選出在3種細胞系的SP細胞中表達均上調2倍以上的microRNA,包括miR-5000-3p、miR-5009-3p和miR-552，對這3種microRNA的表達上調進行RT-PCR驗證。取0.8 μg總RNA, 應用miRNA Isolation Kit (Ambion)分離小于100 nt的小分子RNA, 然后應用MMLV reverse transcriptase (Epicentre)逆轉錄合成cDNA,逆轉錄引物分別為：5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TGCACTGGATACGACTCCAAG-3’(miR-5000-3p)，5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCA-ATTGCACTGGATACGACTTTTGG-3’(miR-5009-3p)，5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TGCACTGGATACGACTTGTCTA-3’(miR-552)，5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(U6)，U6為內參照。再進行定量PCR檢測，PCR擴增引物序列見表1。PCR條件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。采用U6 RNA作為內標，進行歸一化。樣品目的基因的相對表達率(relative expression, RE)采用ΔΔCt方法計算，RE = 2ΔΔCt(Ct表示反應熒光強度顯著大于背景值時的循環(huán)數(shù)，ΔCtsample=Ctsample-CtU6 sample，ΔCtcontrol=Ctcontrol-CtU6 control，ΔΔCt =ΔCtsample-ΔCtcontrol)。

表1 實時定量PCR使用引物列表

4 統(tǒng)計學處理

計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，2組之間均數(shù)的比較采用獨立樣本的t檢驗。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 SP細胞的分選

采用Hoechst 33342標記結腸癌細胞，利用流式細胞術分選結腸癌SP細胞。圖1顯示，不同結腸癌細胞系都有一定比例的SP細胞，只是比例不同。HCT-15、HT-29及LoVo細胞中SP細胞的比例分別為16.75%、13.02%及9.52%;采用50 μmol/L維拉帕米處理后，HCT-15、HT-29及LoVo細胞中SP細胞的比例分別降至1.76%、0.58%及0.11%。

2 各抗腫瘤藥對結腸癌SP細胞和非SP細胞的IC50

HCT-15、HT-29及LoVo細胞分選后的SP細胞及非SP細胞分別采用不同濃度的5-氟尿嘧啶、草酸鉑及阿霉素處理3 d，然后測定各細胞的細胞活力。不同濃度的5-氟尿嘧啶處理HCT-15結腸癌細胞3 d 后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，HCT-15結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞。從表2可見，5-氟尿嘧啶對HCT-15細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理HCT-15結腸癌細胞3 d后，在同一濃度的草酸鉑作用下，HCT-15結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，阿雷素對HCT-15細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近4倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理HCT-15細胞3 d 后，在同一濃度的阿霉素作用下，HCT-15結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，阿霉素對HCT-15細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近6倍，見表2。

Figure 1. Side population analysis of 3 kinds of colon cancer cell lines. A: the ratio of SP cells in HT-29 cell line; B: the ratio of SP cells in LoVo cell line; C: the ratio of SP cells in HCT-15 cell line; D: the ratio of SP cells in HT-29 cell line treated with verapamil; E: the ratio of SP cells in LoVo cell line treated with verapamil; F: the ratio of SP cells in HCT-15 cell line treated with verapamil.

不同濃度的5-氟尿嘧啶處理HT-29結腸癌細胞3 d后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，HT-29結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞。從表2可見，5-氟尿嘧啶對HT-29細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理HT-29結腸癌細胞3 d 后，在同一濃度的草酸鉑作用下，HT-29結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，草酸鉑對HT-29細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近5倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理HT-29結腸癌細胞3 d后，在同一濃度的阿霉素作用下，HT-29結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，阿霉素對HT-29細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近5倍，見表2。

不同濃度的5-氟尿嘧啶處理LoVo細胞3 d后，在同一濃度的5-氟尿嘧啶作用下，LoVo結腸癌細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，從表2可見，5-氟尿嘧啶對LoVo細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近5倍。不同濃度的草酸鉑處理LoVo結腸癌細胞3 d 后，在同一濃度的草酸鉑作用下，LoVo細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，草酸鉑對LoVo細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近6倍，見表2。不同濃度的阿霉素處理LoVo細胞3 d 后，在同一濃度的阿霉素作用下，LoVo細胞中SP細胞的細胞活力均高于非SP細胞，阿霉素對LoVo細胞中SP細胞的IC50較非SP細胞提高了近4倍，見表2。

表2 抗腫瘤藥對3種人結腸癌細胞系SP細胞和非SP細胞的IC50

3 MicroRNA芯片檢測的重復性檢驗

HCT-15、HT-29及LoVo細胞經(jīng)流式細胞術分選出SP細胞及非SP細胞，共6個樣本進行 microRNA芯片檢測，每個樣本重復檢測4次，計算各樣本的相關系數(shù)R(反映樣本檢測的重復性),結果見表3。

表3 各樣本microRNA芯片檢測的相關系數(shù)R值

4 結腸癌SP細胞的microRNA表達譜分析

HCT-15、HT-29及LoVo細胞經(jīng)流式細胞術分選出SP細胞及非SP細胞，采用miRCURY LNATMmicroRNA Array (v.18.0) 檢測各細胞系SP細胞與非SP細胞microRNAs的表達譜，并比較每一細胞系中SP細胞與非SP細胞microRNAs的表達差異，從中篩選出差異達到2倍以上的microRNAs。結果發(fā)現(xiàn)，在HCT-15細胞系，SP細胞中microRNAs表達上調的有106種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、miR-17-5p、miR-3146、miR3619-3p等；表達下調的有52種，包括miR-4664-3p、miR-940、miR-133b、miR-4667-3p、miR-484、miR-4312等(見表4，因版面所限，表中僅分別列出10種表達上調及10種表達下調的microRNAs)。在HT-29細胞系，SP細胞中microRNAs表達上調的有58種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、 miR-611、miR-365b-5p、miR-3667-3p等；表達下調的有63種，包括miR-125b-5p、miR-30b-5p、miR-101-3p、miR-23a-3p、miR-24-3p、let-7g-5p等(見表5，因版面所限，表中僅分別列出10種表達上調及10種表達下調的microRNAs)。在LoVo細胞系，SP細胞中microRNAs表達上調的有47種，包括miR-5000-3p、miR-5009-3p、miR-552、miR-3915、miR-4777-5p、miR-301a-3p等；表達下調的有22種，包括miR-34a-5p、miR-30e-3p、miR-33b-5p、miR-199a-5p、miR-125b-5p、miR-1275等(見表6，因版面所限，表中僅分別列出10種表達上調及10種表達下調的microRNAs)。在3種細胞系中，miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在SP細胞中均表達上調，而沒有1種microRNA在3種細胞系的SP細胞中表達均下調。

5 3種表達上調microRNAs的實時熒光定量PCR驗證

microRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在3種結腸癌細胞系的SP細胞中均表達上調，為確認此結果，我們采用實時熒光定量PCR對該結果進行驗證。以U6為內參照，計算SP細胞與非SP細胞各microRNAs的相對表達量。將3種microRNAs的實時熒光定量PCR結果與microRNA芯片檢測結果比對，在HCT-15細胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細胞較非SP細胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達量分別增加6.76倍、2.37倍和6.96倍，而實時熒光定量PCR檢測結果顯示SP細胞較非SP細胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達量分別增加2.20倍、2.01倍和3.85倍；在HT-29結腸癌細胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細胞較非SP細胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達量分別增加2.25倍、2.26倍和2.81倍，而實時熒光定量PCR檢測結果顯示SP細胞較非SP細胞在miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552表達量分別增加2.35倍、3.46倍和2.63倍；在LoVo細胞系，microRNA芯片檢測顯示SP細胞較非SP細胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達量分別增加3.28倍、2.35倍和8.13倍，而實時熒光定量PCR檢測結果顯示SP細胞較非SP細胞miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552的表達量分別增加2.57倍、2.00倍和2.59倍。上述結果顯示出microRNA芯片檢測結果與實時熒光定量PCR檢測結果具有良好的一致性。

表4 HCT-15人結腸癌細胞系SP細胞與非SP細胞間microRNA的差異表達

表5 HT-29人結腸癌細胞系SP細胞與非SP細胞間microRNA的差異表達

表6 LoVo人結腸癌細胞系SP細胞與非SP細胞間microRNA的差異表達

討 論

在本研究中，我們采用Hoechst 33342熒光染料，利用流式細胞術從結腸癌細胞系中成功分離出結腸癌SP細胞。SP細胞最先由Goodell等[9]于1996年報道描述。Haraguchi等[10]從胃腸道腫瘤細胞系中分離出SP細胞，盡管他們從肝癌細胞系Huh7中分離出SP細胞，并報道了該SP細胞的基因表達譜以及對化療藥物的耐藥性，但他們尚未報道SP細胞的microRNA表達譜。Schetter等[11]和Callari等[12]報道了結腸癌細胞的microRNA表達譜，但他們采用的結腸癌細胞來源于結腸癌患者的組織標本，他們并未報道結腸癌SP細胞的microRNA表達譜。在本研究中，我們從3種結腸癌細胞系包括HCT-15、HT-29及LoVo細胞系中成功分離純化出結腸癌SP細胞。流式細胞術分析檢測發(fā)現(xiàn)，HCT-15、HT-29及LoVo細胞系的SP細胞比例分別為16.75%、13.02% 及9.52%。Inoda等[13]報道HCT-15、HT-29及LoVo細胞系的SP細胞比例分別為11.1%、10.4%和9.1%。本研究測定的HCT-15、HT-29及LoVo細胞系的SP細胞比例與Inoda等[13]報道的比例相似。這說明每一種結腸癌細胞系均含有一定比例的SP細胞，只是SP細胞的比例有所不同。

從HCT-15、HT-29及LoVo細胞系分選出的SP細胞和非SP細胞分別采用不同濃度的5-氟尿嘧啶、草酸鉑及阿霉素處理3 d。本研究發(fā)現(xiàn)，不論是HCT-15及HT-29細胞系，還是LoVo細胞系，在相同濃度的5-氟尿嘧啶作用下，從這3種結腸癌細胞系中分選出的SP細胞的細胞活力均明顯高于非SP細胞的細胞活力。這表明結腸癌細胞系中的SP細胞比非SP細胞對5-氟尿嘧啶更耐藥。類似的結果在采用草酸鉑或阿霉素處理時同樣也可見到。由此可見，結腸癌細胞系中的SP細胞比非SP細胞對化療藥更耐藥。Inoda等[13]報道從結腸癌細胞系SW480、HT-29及HCT-15中分選出的SP細胞比非SP細胞對諸如irinotecan或etoposide等化療藥更耐藥。所有這些均表明結腸癌細胞中的SP細胞比非SP細胞對化療藥物更具抵抗性。由此可見，結腸癌細胞中的SP細胞在結腸癌的多藥耐藥性中起著非常重要的作用。

既然SP細胞在結腸癌的多藥耐藥性中起著非常重要的作用，因此本研究想探討結腸癌SP細胞的特異的生物標志，以便通過靶向調節(jié)這些生物標志的表達而達到逆轉結腸癌細胞的多藥耐藥性。在以往的研究中，Behbod等[8]曾探討過乳腺癌SP細胞的基因標志，基因芯片分析提示乳腺癌細胞中的SP細胞是一類表達調節(jié)細胞周期關鍵基因的乳腺細胞亞群。本研究采用microRNA芯片對結腸癌細胞系中的SP細胞及非SP細胞進行了microRNA表達譜的分析，通過比較SP細胞與非SP細胞microRNA表達的差異，旨在探索結腸癌SP細胞的microRNA生物標志。本研究采用的microRNA檢測芯片為Exiqon的miRCURYTMLNA Array (V.18.0)，該microRNA芯片是目前最新版本的microRNA芯片檢測系統(tǒng)，可同時檢測2 000多種microRNAs。表3顯示的是各樣本microRNA芯片重復檢測的相關系數(shù)R值，同一樣本，R值越大則表示芯片檢測的重復性越好，從表3可以看出，各樣本重復檢測的相關系數(shù)R值均接近1，說明各樣本芯片檢測的重復性非常好，同時也說明該芯片檢測結果的可靠性。

通過對各樣本進行microRNA芯片檢測，我們發(fā)現(xiàn)，在HCT-15、HT-29 及LoVo細胞系，有3種microRNAs包括miR-5000-3p、miR-5009-3p及miR-552在這3種結腸癌細胞系的SP細胞中均表達上調。但沒有發(fā)現(xiàn)一種microRNA在這3種結腸癌細胞系的SP細胞中均表達下調。而且這些發(fā)現(xiàn)通過RT-PCR的方法同時也得到了證實。在以往的研究中，Schetter等[11]和Callari等[12]曾報道結腸癌細胞的microRNA表達譜。但他們采用的結腸癌細胞樣本來源于結腸癌患者的結腸癌組織標本。Alexander等[14]報道了結腸癌患者的糞便microRNAs表達譜，但該研究比較的是結腸癌患者與健康志愿者的糞便標本。Hofsli等[15]探討了結腸癌患者的血清microRNAs表達譜，但該研究比較的是結腸癌患者與健康對照者的血清標本。盡管Zhang等[16]和Fang等[17]曾探討過結腸癌干樣細胞microRNAs的表達譜，但他們采用的結腸癌干樣細胞是基于CD133或CD133/CD44細胞標記分選獲得的細胞，而不是SP細胞。除此之外，該研究僅采用一種結腸癌細胞系來比較結腸癌干樣細胞與非干樣細胞microRNAs表達譜的差異。上述所有的研究均未進行對結腸癌SP細胞microRNA表達譜的探討。因此，本研究是首次報道結腸癌SP細胞microRNA表達譜的檢測，并比較結腸癌SP細胞與非SP細胞microRNA表達譜的差異，以探索結腸癌SP細胞的microRNA生物標志。

本研究通過分析比較3種結腸癌細胞系包括HCT-15、HT-29及LoVo的SP細胞與非SP細胞microRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)有3種microRNA包括miR-5000-3p、miR-5009-3p 及miR-552在這3種結腸癌細胞的SP細胞中均表達上調，而其它的microRNA在結腸癌SP細胞中表達沒有變化，或者只是在其中的1種或2種結腸癌SP細胞中有改變，提示miR-5000-3p、miR-5009-3p 及miR-552可能是結腸癌SP細胞潛在的microRNA生物標志。我們知道，SP細胞在結腸癌的多藥耐藥性中具有重要的作用，針對SP細胞的靶向治療有可能逆轉結腸癌的多藥耐藥性，因此這3種microRNA有可能成為結腸癌治療的潛在靶點。在將來的研究中，可以采用針對這3種microRNA的反義RNA靶向抑制特異microRNA的表達，以進一步探討靶向miR-5000-3p、miR-5009-3p或miR-552的反義RNA能否逆轉結腸癌細胞的多藥耐藥性。

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