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        野木瓜注射液對(duì)炎性疼痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)COX-2表達(dá)的影響*

        2014-08-08 09:47:00楊燕京李小軍劉力維李玉桑奉黎靜唐和斌
        中國病理生理雜志 2014年7期
        關(guān)鍵詞:角叉菜膠背根足趾

        楊燕京, 李小軍, 劉力維, 郭 強(qiáng), 李玉桑, 奉黎靜, 唐和斌

        (中南民族大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)研究室,湖北 武漢 430074)

        野木瓜為木通科(Lardizabalaceae)野木瓜屬植物,拉丁學(xué)名StauntoniachinensisDC.,有強(qiáng)心利尿、驅(qū)蟲止痛之功效[1]。野木瓜注射液(injection staun-toniae,IS)是從野木瓜中提取的有效成分,通過加工提取精制而成的一種中藥注射液[2]。已有許多文獻(xiàn)和臨床試驗(yàn)觀察表明,野木瓜注射液具有抗炎消腫和止痛作用,可用于各種術(shù)后止痛、卒中后肩痛、臀上皮神經(jīng)卡壓綜合癥等[1]。彭小莉等[3]證實(shí)野木瓜注射液能預(yù)防和緩解大鼠足底皮下化學(xué)組織損傷誘致的持續(xù)性自發(fā)痛;劉向明等[4]利用微電極細(xì)胞外記錄技術(shù),觀察得出野木瓜注射液可以在外周水平上阻滯Wistar大鼠痛覺信息的傳導(dǎo),是其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的原因之一。然而尚未見野木瓜注射液經(jīng)治療炎性疼痛反應(yīng)與環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)表達(dá)有關(guān)的研究報(bào)道。COX-2是前列腺素合成的一種誘導(dǎo)型限速酶,催化前列腺素合成參與炎癥反應(yīng)[5]。本文從疼痛行為學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)角度出發(fā),研究野木瓜注射液對(duì)足底慢性炎癥疼痛模型小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)COX-2的表達(dá)干預(yù)及抗炎鎮(zhèn)痛的作用,為其臨床應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 材料與儀器

        SPF級(jí)昆明小鼠由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供,體質(zhì)量20~25 g,雄性,許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005;野木瓜注射液(廣東和平制藥,2 mL×6,含總黃酮不少于0.24 mg);角叉菜膠(Sigma);COX-2蛋白免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);足底測(cè)痛儀。

        2 動(dòng)物分組

        動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22~25 ℃,濕度30%~40%。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后,將60只小鼠隨機(jī)均分為5組,每組12只:(1) 對(duì)照組;(2) 模型組;(3) 低劑量野木瓜注射液治療組;(4) 中劑量野木瓜注射液治療組;(5) 高劑量野木瓜注射液治療組。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”[6]。

        3 方法

        造模開始前,分別檢測(cè)各組小鼠足趾腫脹程度和熱痛閾值,與各組小鼠(除對(duì)照組注射50 μL生理鹽水)左后足一次性皮內(nèi)注射50 μL 1%角叉菜膠,建立小鼠慢性炎性疼痛模型,造模后,即刻采取背部皮下注射方式給藥,其中治療組小鼠分別給予1.2 μL/g相應(yīng)劑量的野木瓜注射液;模型組和對(duì)照組給予等劑量的注射用水。在造模后4 h、12 h、24 h和48 h檢測(cè)各組小鼠足趾腫脹程度和熱痛閾值,并取小鼠背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行COX-2免疫組化染色。

        3.1小鼠足趾大體觀察方法 足趾腫脹測(cè)量:采用

        足趾容積測(cè)量?jī)x測(cè)定小鼠足趾的腫脹體積。固定小鼠后足,在踝關(guān)節(jié)處作一標(biāo)記線,將小鼠后足浸入測(cè)量?jī)x的液體中,浸入的深度以標(biāo)記線為界,然后取出小鼠足趾,記錄液體的排出量,即為小鼠的足趾體積,計(jì)算小鼠造模4 h、12 h、24 h和48 h后不同時(shí)點(diǎn)的足趾腫脹程度。每只小鼠均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。時(shí)點(diǎn)的足趾腫脹程度(%)=(時(shí)點(diǎn)的足趾體積-注射前足趾體積)/ 注射前足趾體積×100%。

        3.2小鼠行為學(xué)測(cè)試方法 熱痛閾值的測(cè)定:將小鼠放置于足底測(cè)痛儀玻璃板上的格子里,待其安靜后,開啟玻璃板下方的紅外輻射燈照射其足底,依據(jù)記錄儀器上所顯示的時(shí)間,測(cè)定小鼠足底熱痛閾值。每只小鼠均重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),每次至少間隔5 min,取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

        3.3小鼠背根神經(jīng)節(jié)L5 DRG細(xì)胞中COX-2的表達(dá) 斷頭處死小鼠后取小鼠第5腰椎(lumbar 5, L5)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)固定并且石蠟包埋,進(jìn)行COX-2蛋白的免疫組織化學(xué)染色。COX-2蛋白陽性表達(dá)時(shí)呈棕黃色片狀或顆粒狀,根據(jù)陽性細(xì)胞分布情況,每張切片選取3個(gè)不同的視野,采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)半定量計(jì)算COX-2蛋白的表達(dá)[7]。

        4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0.1科學(xué)統(tǒng)計(jì)繪圖軟件分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,組間和組內(nèi)比較均采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 野木瓜注射液對(duì)小鼠足趾腫脹的影響

        1%角叉菜膠造模后,模型小鼠左后足均明顯紅腫。小鼠組織腫脹程度統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1可見,在角叉菜膠注射后,模型組小鼠的足趾腫脹程度相對(duì)于造模前持續(xù)顯著升高,注射角叉菜膠后48 h,與對(duì)照組(100%±3%)相比,模型組(203%±6%)足趾腫脹明顯??梢娊遣娌四z皮內(nèi)注射引發(fā)小鼠組織明顯水腫、炎癥反應(yīng)。注射角叉菜膠后48 h,與模型組相比,野木瓜注射液低、中、高劑量治療組小鼠的足趾腫脹度顯著降低(171%±10%、174%±12%和171%±4%),表明野木瓜注射液可以有效減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

        Figure 1. Paw edema changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 24 h.

        2 小鼠足底熱痛閾值

        由圖2可見,皮內(nèi)注射角叉菜膠后,與對(duì)照組(16.1 s±0.6 s)相比,模型組小鼠足底熱痛閾值顯著降低(9.8 s±0.9 s),在注射后4 h降到最低,表明角叉菜膠注射后,模型組小鼠對(duì)熱痛的敏感性明顯升高。注射角叉菜膠后48 h,相對(duì)于模型組(11.8 s±1.1 s),野木瓜注射液低、中、高劑量治療組小鼠的足底熱痛閾值(16.7 s±4.3 s、17.5 s±0.9 s和18.8 s±1.6 s)明顯升高,其中高劑量野木瓜注射液治療組小鼠的足底熱痛閾值恢復(fù)到對(duì)照組的121%。這表明,野木瓜注射液可以有效抑制角叉菜膠皮內(nèi)注射引發(fā)的痛覺過敏,并且其藥物作用時(shí)間持久。

        Figure 2. Pain threshold changes in the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs respective control; #P<0.05 vs model at 48 h.

        3 小鼠背根神經(jīng)節(jié)COX-2表達(dá)

        小鼠背根神經(jīng)節(jié)COX-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖3。在對(duì)照組,小鼠L5 DRG細(xì)胞中無明顯COX-2蛋白表達(dá)。模型組小鼠L5 DRG細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)明顯。治療組經(jīng)過治療后,小鼠L5 DRG細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)有所下調(diào)。在角叉菜膠注射后12 h、24 h和48 h,模型組小鼠的L5 DRG細(xì)胞中的 COX-2表達(dá)(323%±18%、324%±24%和342%±15%)較對(duì)照組(100%±23%、119%±16%和119%±10%)顯著增加,見圖4。而在注射角叉菜膠后48 h,低、中、高劑量野木瓜注射液治療組小鼠L5 DRG細(xì)胞中的COX-2表達(dá)(238%±23%、225%±16%和102%±12%)較模型組顯著降低,有劑量依賴性。由此我們推斷,野木瓜注射液可能是通過干預(yù)背根神經(jīng)節(jié)中COX-2蛋白表達(dá)來抑制炎癥進(jìn)而阻止疼痛的傳導(dǎo)。

        討 論

        炎性疼痛是由于創(chuàng)傷、外科手術(shù)以及細(xì)菌或病毒感染等引發(fā)外周組織損傷而導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為局部的紅、腫、熱、痛與功能障礙,是臨床常見的疾病之一[8]。在炎癥的早期,某些炎癥介質(zhì)刺激血管,使血管擴(kuò)張,血管內(nèi)皮間隙擴(kuò)大,血管壁通透性增強(qiáng),血漿內(nèi)的液體、蛋白質(zhì)和白細(xì)胞等滲出到組織間隙,造成組織腫脹,因此,炎癥滲出、組織腫脹是炎癥早期的重要指標(biāo)[9]。本研究采用的1%角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠足底疼痛模型可以有效地產(chǎn)生炎性應(yīng)答。根據(jù)形態(tài)學(xué)結(jié)果分析,野木瓜注射液具有抗炎消腫作用。

        COX-2與炎癥反應(yīng)、疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān),其在中樞和周邊神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)水平因組織損傷和由此產(chǎn)生的炎癥誘導(dǎo)而增加[10]。COX-2表達(dá)增加使前列腺素合成增加,后者通過激活環(huán)磷酸腺苷和蛋白激酶A通路,加強(qiáng)脊髓疼痛信號(hào)以及突觸傳遞,引起外周傷害性神經(jīng)末梢敏化,炎癥局部出現(xiàn)痛覺過敏[11]。近年的研究表明,通過下調(diào)COX-2蛋白表達(dá)可阻礙P物質(zhì)的合成和釋放,進(jìn)而產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)中角叉菜膠處理小鼠用藥治療前后足底熱痛閾值對(duì)比,顯示野木瓜注射液具有良好的鎮(zhèn)痛作用。同時(shí),COX-2蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,48 h時(shí),治療組各組小鼠背根神經(jīng)節(jié)COX-2蛋白的表達(dá)均低于模型組,并且高劑量野木瓜注射液治療組背根神經(jīng)節(jié)COX-2蛋白的表達(dá)降低到正常水平。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,野木瓜注射液可以通過干預(yù)COX-2蛋白表達(dá),減輕角叉菜膠引起的炎癥水腫,從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的良好效果。

        Figure 3. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments by an immunochemical method.Bar=50 μm.

        Figure 4. The expression of COX-2 in the DRG of the mice with different treatments.Mean±SEM.n=3.**P<0.01 vs respective control; #P<0.05, ##P<0.01 vs respective model.

        [參 考 文 獻(xiàn)]

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