林 娜， 左婉紅， 賴周毅， 伍嘉寶， 陳美苑， 汪 源， 陳麗新△， 王立偉△

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)系， 2藥理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

乙醇是酒的主要成分，近年的研究表明，飲酒與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-3]，鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)的高發(fā)腫瘤，流行病學(xué)顯示飲酒和人類鼻咽癌的發(fā)生具有相關(guān)性[3]，但其確切機(jī)制并不明了。氯通道在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，并且我們前文中報(bào)道容積敏感性氯通道在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和容積調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[4-8]。目前國(guó)內(nèi)外研究乙醇和離子通道的關(guān)系主要為陽(yáng)離子通道，對(duì)陰離子通道的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)膜片鉗技術(shù)觀察乙醇對(duì)CNE-2Z細(xì)胞氯通道的影響。ClC-3蛋白被認(rèn)為是容積敏感性氯通道重要的候選蛋白之一，利用siRNA干擾技術(shù)沉默ClC-3氯通道探討乙醇誘導(dǎo)氯電流性質(zhì)的改變，進(jìn)一步分析其電流的分子本質(zhì)，更好地了解和闡明乙醇影響腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)制，為鼻咽癌惡性腫瘤的治療提供新的靶標(biāo)和生物學(xué)干預(yù)手段。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

低分化鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPM I-1640 培養(yǎng)基、37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，用0.25%胰酶和0.02% EDTA隔天傳代。

2 膜片鉗實(shí)驗(yàn)

2.1電極內(nèi)液、灌流液、氯通道阻斷劑 電極內(nèi)液(mmol/L)含70 N-methyl-D-glucamine chloride (NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-mannitol和2 ATP，調(diào)pH值至7.25，實(shí)驗(yàn)前加入ATP。等滲液(mmol/L)含70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-mannitol。47%高滲液含280 D-mannitol,其它成分同等滲液。調(diào)pH值至7.4,冰點(diǎn)滲透壓計(jì)檢測(cè)滲透壓分別為300和440 mOsmol/L。氯通道阻斷劑5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, NPPB] (Sigma)用DMSO配成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，用前用灌流液稀釋至100 μmol/L。

2.2全細(xì)胞膜片鉗記錄 胰酶消化細(xì)胞貼于22 mm玻片上，1 h后從培養(yǎng)箱中取出，貼于灌流槽內(nèi)。用EPC-7膜片鉗放大器在全細(xì)胞電壓鉗制模式下記錄全細(xì)胞電流，鉗制細(xì)胞在0、±40 mV、±80 mV往復(fù)循環(huán)，每個(gè)鉗制脈沖波寬200 ms，間隔為4 s。用等滲灌流穩(wěn)定3～5 min，記錄穩(wěn)定的基礎(chǔ)電流，加入不同濃度乙醇，待電流達(dá)到穩(wěn)定的峰值，加入高滲或氯通道阻斷劑分析乙醇激活電流的生理學(xué)及藥理學(xué)特性。

2.3高滲及氯通道阻斷劑抑制全細(xì)胞電流 待激活電流達(dá)到高峰穩(wěn)定3 min加入含相應(yīng)濃度乙醇的47%高滲溶液或氯通道阻斷劑NPPB。抑制率(%)的計(jì)算公式為[(CEtOH-CIso)-(Cblock- CIso)]/(CEtOH-CIso)×100%。其中CIso、CEtOH、Cblock分別為±80 mV電壓鉗制下等滲、乙醇、乙醇加高滲或阻斷劑時(shí)的電流值。

3 siRNA干擾ClC-3基因的表達(dá)

ClC-3 siRNA雙鏈正義鏈序列5’-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3’，反義鏈序列5’-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3’；對(duì)照組無(wú)序siRNA正義鏈序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。siRNA標(biāo)記有5-FAM熒光基團(tuán)。參考我們以前發(fā)表的方法[9]，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后在熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。48 h后消化細(xì)胞并貼片，在熒光顯微鏡下選取帶熒光(siRNA轉(zhuǎn)染成功)的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。灌流乙醇，觀察激活氯通道的情況，分析該電流特性的改變。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用SPSS 13.0軟件處理,采用F檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度乙醇激活CNE-2Z細(xì)胞氯電流

當(dāng)CNE-2Z細(xì)胞浸浴在等滲灌流液中，細(xì)胞電流小而穩(wěn)定。待穩(wěn)定3 min后在等滲灌流液中加入不同濃度的乙醇(0.17、1.7、17、85和170 mmol/L)灌流細(xì)胞,激活的電流具有濃度依賴性，+80 mV鉗制電壓下激活的電流密度呈倒U型，17 mmol/L乙醇激活的電流密度達(dá)到峰值，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The chloride current activated by ethanol with different concentration at ±80 mV in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.

2 乙醇誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞氯電流的容積敏感性

如圖2所示，在+80 mV和-80 mV電壓鉗制下背景電流穩(wěn)定而微弱，待電流穩(wěn)定3 min后細(xì)胞外灌流17 mmol/L乙醇后，內(nèi)外向電流均明顯增大呈較明顯的外向優(yōu)勢(shì)，在±80 mV無(wú)明顯的電壓依賴性失活，翻轉(zhuǎn)電位是(-4.4±3.7)mV,接近氯離子的平衡電位-0.9 mV。穩(wěn)定后，胞外灌流47%高滲溶液，內(nèi)外向電流均受到明顯抑制(P<0.01)，高滲液對(duì)內(nèi)外向電流的抑制率間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

Figure 2. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by hypertonicity in CNE-2Z cells. A: the typical course of current recordings; B: the inhibition ratio of the current by hypertonicity at ±80 mV.Mean±SD.n=9.

當(dāng)乙醇(17 mmol/L)激活的電流達(dá)高峰并平穩(wěn)后，用相同濃度的葡萄糖酸鈉替代灌流液中的氯化鈉(70 mmol/L)，即用葡萄糖酸根離子置換氯離子。結(jié)果顯示，乙醇激活的電流明顯減弱，+80mV時(shí)的電流密度減少了75.5%±1.5% (P<0.01)，翻轉(zhuǎn)電位由(-4.4±3.7)mV變?yōu)?18.2±1.9)mV。

3 氯通道阻斷劑抑制乙醇誘導(dǎo)的CNE-2Z細(xì)胞氯電流

利用氯通道阻斷劑NPPB觀察該電流的藥理學(xué)特性。待乙醇激活的氯電流達(dá)到高峰穩(wěn)定3 min后加入100 μmol/L NPPB可見(jiàn)內(nèi)外向電流均被明顯抑制(P<0.01)。

Figure 3. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by the chloride channel blocker NPPB in CNE-2Z cells. A： the typical course of current recordings; B: the inhibition of the ethanol-induced chloride currents by NPPB at ±80 mV.Mean±SD.n=5.

4 沉默ClC-3氯通道的表達(dá)對(duì)乙醇誘導(dǎo)電流的影響

4.1熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 利用siRNA技術(shù)干擾ClC-3氯通道基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，圖4所示ClC-3 siRNA已被成功轉(zhuǎn)染到CNE-2Z細(xì)胞。圖4A是明場(chǎng)拍攝條件下的細(xì)胞形態(tài)，圖4B是轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的熒光圖像，圖4C是不加ClC-3 siRNA的對(duì)照組熒光圖像(其明場(chǎng)拍攝條件下的細(xì)胞形態(tài)未顯示)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組的大部分細(xì)胞可檢測(cè)到熒光，而對(duì)照組則無(wú)熒光。

Figure 4. Inhibition of ethanol-induced chloride currents by ClC-3 siRNA. A～C: transfection efficiency of ClC-3 siRNA detected by the fluorescence microscope; D: I-V relationships. Mean±SD.n=14.**P<0.01 vs ethanol (control) group.

4.2膜片鉗記錄轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA后乙醇激活的氯電流 成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，按照上述方法，用膜片鉗記錄等滲液中CNE-2Z細(xì)胞的氯電流。背景氯電流穩(wěn)定而微弱， 待其穩(wěn)定3 min灌流17 mmol/L乙醇，達(dá)到峰值穩(wěn)定3 min，灌流高滲或氯通道阻斷劑。記錄細(xì)胞的I-V曲線。與未經(jīng)ClC-3 siRNA處理的CNE-2Z細(xì)胞相比，乙醇激活的氯電流密度明顯減小，見(jiàn)圖4D(P<0.01)。

討 論

目前認(rèn)為乙醇與多種惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，以消化系統(tǒng)腫瘤如口、咽喉、食管、肝、胃、結(jié)直腸等部位的腫瘤和乳腺癌、肺癌、前列腺癌多見(jiàn)[2]。鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)的高發(fā)惡性腫瘤，由于鼻咽解剖位置較深,結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 并且以非角化型未分化癌為主,極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響病人生存。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酗酒與鼻咽癌呈正性相關(guān)[3]，因此探討其本質(zhì)顯得尤為重要。

本研究表明，乙醇可以激活一個(gè)較大的電流，此電流的翻轉(zhuǎn)電位接近氯離子平衡電位，用葡萄糖酸根離子替代溶液中的氯離子可以抑制該電流，并使翻轉(zhuǎn)電位遠(yuǎn)離氯離子的平衡電位，表明此電流主要是由氯離子介導(dǎo)，即一定劑量的乙醇可以激活鼻咽癌細(xì)胞的氯通道，并且結(jié)果還提示，乙醇敏感的氯通道對(duì)葡萄糖酸根離子也有一定的通透性。人血液中乙醇濃度達(dá)17 mmol/L是臨床上表現(xiàn)為急性乙醇中毒的臨界值，本實(shí)驗(yàn)中此濃度的乙醇在低分化鼻咽癌細(xì)胞上激活一氯電流，并能夠被氯通道阻斷劑NPPB所阻斷，同時(shí)能被高滲溶液所抑制，具有容積敏感性。并且我們前文中報(bào)道容積敏感性氯通道在細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[4-8]，但其確切的分子本質(zhì)并不清楚。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度過(guò)高時(shí)，其激活氯電流的效應(yīng)明顯下降甚至消失，其機(jī)制不清楚，我們以前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATP對(duì)氯通道也有類似的雙相作用。

ClC-3是氯通道的一個(gè)亞型，被認(rèn)為是容積敏感性氯通道最重要的候選蛋白之一，在細(xì)胞的電活動(dòng)、容積調(diào)控、細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和胞內(nèi)酸堿調(diào)節(jié)中都起著重要作用[8-10]。我們前期實(shí)驗(yàn)證明ClC-3氯通道基因在CNE-2Z細(xì)胞上呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[4]，為了進(jìn)一步探討乙醇激活此種氯電流的分子本質(zhì)，我們采用siRNA技術(shù)干擾ClC-3氯通道蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染序列由本課題前期實(shí)驗(yàn)證明為有效序列[9],利用膜片鉗記錄相同濃度乙醇激活的氯電流，在CNE-2Z細(xì)胞激活的內(nèi)外向氯電流都明顯減小,提示ClC-3氯通道可能是乙醇激活氯電流的主要分子基礎(chǔ)。將ClC-3干擾之后，17 mmol/L乙醇仍能夠記錄到一較微弱的氯電流，提示由于腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，可能還有其它的通道蛋白介導(dǎo)這種電流的產(chǎn)生，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

本研究表明，一定劑量乙醇可以激活氯通道，誘發(fā)一個(gè)容積敏感的氯電流，而ClC-3氯通道蛋白是乙醇誘導(dǎo)氯電流的分子基礎(chǔ)。我們以前的實(shí)驗(yàn)表明，氯通道參與細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期的調(diào)控，并與鼻咽癌細(xì)胞的高增殖特性有關(guān)，提示乙醇可以通過(guò)激活氯通道促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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