楊金部，張宗舟，茍 萍＊＊

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046;2.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001)

豬苓Polyporus umbellatus(Pets)Fr.，是一種珍貴的真菌類中藥材，屬于國家保護(hù)品種[1，2]。豬苓含有多糖類、甾體類、氨基酸類、維生素類及微量無機元素等多種對人體有益的成分，具有利尿、抗癌和抗菌的作用，因此在醫(yī)學(xué)上被稱為“藥材烏金”[3，4]。鑒于甘肅省隴南市得天獨厚的自然環(huán)境以及資源優(yōu)勢，“隴南豬苓”品質(zhì)優(yōu)良、有效成分含量高[5]。隨著醫(yī)療保健的發(fā)展，豬苓的市場需要越來越大，僅靠采挖野生豬苓是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。長期以來，一些學(xué)者對豬苓的栽培、生態(tài)環(huán)境等進(jìn)行了研究。上世紀(jì)70年代，隴南市人工栽培豬苓成功，屬全國首創(chuàng)[6]。豬苓生長土壤為微酸性，腐殖質(zhì)層較厚，礦物質(zhì)含量豐富，土壤中蜜環(huán)菌及其它微生物較多[5]，豬苓與蜜環(huán)菌為特殊的共生關(guān)系[7－10]。2012年，豬苓菌核半野生栽培技術(shù)試驗成功，并開始大面積栽培種植豬苓[11]。豬苓具有較好的藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[12，13]，因此對豬苓成分和藥理作用的研究較多，但對豬苓生長土壤中微生物區(qū)系的研究，尚無詳細(xì)的報道。因此，考察豬苓生長土壤中微生物分布、種類及數(shù)量，對于更好地開發(fā)和利用豬苓資源有重要的意義。本文探究比較豬苓生長土壤與自然土壤 (非豬苓生長土壤)中微生物區(qū)系，為豬苓的大面積種植和人工栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬苓生長土壤采集于隴南市武都區(qū)山墩溝，隨機選取3個有代表性的豬苓生長地椴木根際土壤，海拔高度為1500 m～2000 m，土層深度10 cm～15 cm，土壤為山地暗棕壤。

自然土壤 (非豬苓生長土壤)采集于天水師范學(xué)院教學(xué)樓后草坪上隨機選取3個有代表的點，土層深度5 cm～15 cm，土壤肥沃，屬于自然土，含水量與豬苓土壤相近。

1.2 實驗器材與藥品

器材:培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、移液槍、酒精燈、ACS－DII三峰牌計重秤等。

藥品:牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、酵母膏、孟加拉紅、尿素、 (NH4)2SO4·7H2O、NaCl、KNO3、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4·3H2O、Na2HPO4、CaCl2、K2HPO4、C2H12O6、FeCl3、NaNO3、剛果紅、瓊脂等。

1.3 培養(yǎng)基

按照參考文獻(xiàn)[14]培養(yǎng)基配方如下:

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g，自來水1000 mL，pH7.2～7.4。

高氏一號培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g、KNO31 g、NaCl 0.5 g、KH2PO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH7.4～7.6。

酵母膏培養(yǎng)基:C2H12O650 g、(NH4)2SO4·7H2O 1 g、尿素 1 g、KH2PO4·3H2O 2.5 g、Na2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 1 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、酵母膏0.5 g、孟加拉紅0.03 g、瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH4.5。

孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨5 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素 0.1 g、C2H12O610 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4·3H2O 1 g、瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。

自生固氮菌培養(yǎng)基:C2H12O610 g、KH2PO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、1%剛果紅 5 mL、瓊脂 18 g、NaCl 0.1 g，自來水1000 mL，pH7.0～7.2。

Hvtchison 氏培養(yǎng)基:KH2PO4·3H2O 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.1 g、CaCl20.1 g、FeCl30.01 g、NaNO32.5 g、瓊脂18 g，自來水1000 mL，pH7.2～7.4。

1.4 方法

1.4.1 土壤含水量測定

準(zhǔn)確稱取新鮮豬苓土壤和自然土壤各2份，每份1 g，一份測量土壤含水量，即將土壤放在干燥箱 (160℃)干燥2 h至恒重，迅速精密稱定重量，記錄數(shù)據(jù)。另一份放入冰箱冷藏，用于測定其中的微生物。土壤含水率 (P)公式為:

P=(M1－M2)/M2×100%

式中:M1表示濕土重;M2表示烘干土重。

1.4.2 土壤微生物數(shù)量的測定

(1)培養(yǎng)基制備

將1.3中的不同培養(yǎng)基按配方配制裝入三角瓶，121℃下高壓鍋滅菌20 min，在超凈工作臺倒平板。

(2)菌懸液制備

在無菌條件下，將1 g新鮮豬苓土壤和1 g自然土壤分別加入到100 mL無菌水中，振蕩搖勻，即得到濃度為10－2的懸浮液;用1 mL無菌移液管吹吸懸浮液3次，吸取1 mL溶液加到9 mL無菌水的試管中，吹吸混勻，即為10－3濃度的懸浮液;以同樣的方法連續(xù)稀釋土壤溶液，濃度依次為10－4、10－5、10－6、10－7。

(3)菌體培養(yǎng)

按照參考文獻(xiàn)[15]，培養(yǎng)細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分別接種0.1 mL三種不同濃度 (10－5～10－7)的土壤溶液:用涂布棒涂勻，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察記錄數(shù)據(jù)。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，并以無菌水作對照。

培養(yǎng)放線菌用高氏一號培養(yǎng)基，土壤溶液濃度為10－2～10－4;培養(yǎng)霉菌用孟加拉紅培養(yǎng)基，土壤溶液濃度為10－3～10－5;培養(yǎng)酵母菌用酵母膏培養(yǎng)基，土壤溶液濃度為10－2～10－4;培養(yǎng)固氮菌用自生固氮菌培養(yǎng)基，土壤溶液濃度為10－5～10－7;培養(yǎng)纖維素細(xì)菌用Hvtchison氏培養(yǎng)基，土壤溶液濃度為10－5～10－7;菌體培養(yǎng)方法同上。

(4)霉菌的分離、純化和保存

待霉菌菌落在平板培養(yǎng)皿上生長旺盛時，用無菌接菌環(huán)挑取少量孢子，接種到新鮮的孟加拉紅培養(yǎng)基上作平板劃線，28℃培養(yǎng)。經(jīng)2次～3次平板劃線后得到初步純化的霉菌，從培養(yǎng)36 h的劃線平板上選取單菌落，用無菌針挖出并移植到新的孟加拉紅平板培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)3 d后，得到純種培養(yǎng)菌落。經(jīng)過分離純化得到的純菌落，接種到斜面培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，將已有明顯菌落的斜面培養(yǎng)基用牛皮紙、線繩包扎好，放入4℃的冰箱里進(jìn)行儲存。

(5)霉菌的初步鑒定

觀察平板培養(yǎng)基上菌落的特征，如菌落顏色、形狀、直徑、表面是否光滑、有無同心環(huán)、邊緣是否整齊，菌絲的高矮、緊密度，孢子的顏色、形狀;培養(yǎng)基顏色變化、氣味，以及菌落生長速率等，可初步確定可能的菌種。對部分菌種進(jìn)行顯微鏡鏡檢，觀察孢子囊的形態(tài)、大小、著生方式，藏卵器的形狀、著生方式，突起物的有無及其形狀，雄器的形狀、數(shù)目、位置，是否有柄及柄的形態(tài)等特征，進(jìn)一步確定霉菌中菌株的類型。

(6)菌落的計數(shù)

根據(jù)各微生物菌落特征和顯微特征，分別計數(shù)每個培養(yǎng)皿中同類型單菌落的數(shù)量。所得的菌落數(shù) (N，cfu·g－1)計算公式為:

N=N1×n

式中:N1為培養(yǎng)皿中的菌落數(shù);n為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤含水量

通過測定土壤含水量可知，豬苓生長土壤與自然土壤水分含量相差不大，均約為30%，見表1。

表1 土壤含水量

2.2 豬苓生長土壤和自然土壤中微生物區(qū)系

用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，通過菌落特征和顯微細(xì)胞觀察，從豬苓生長土壤和自然土壤均得到主要的6種類型微生物，見表2、表3。

表2 豬苓生長土壤微生物區(qū)系

表3 自然土壤微生物區(qū)系

豬苓生長土壤中細(xì)菌、纖維素分解菌和固氮菌的菌落數(shù)較多，霉菌次之，放線菌、酵母菌較少。自然土壤中細(xì)菌菌落數(shù)較多，放線菌、酵母、菌霉菌次之，固氮菌和纖維素分解菌較少。

2.3 豬苓生長土壤與自然土壤中微生物區(qū)系比較

不同地域的土壤類型、含水量、肥力以及微生物數(shù)量和種類是不同的。通過比較豬苓生長土壤和自然土壤中的微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)2種土壤微生物菌落數(shù)量差別較大，見表4。

表4 豬苓生長土壤與自然土壤微生物區(qū)系比較

豬苓生長土壤中霉菌、固氮菌、纖維素分解菌菌落數(shù)均高于自然土壤，纖維素分解菌菌落數(shù)比自然土壤高3個數(shù)量級，固氮菌高兩個數(shù)量級，霉菌高1個數(shù)量級。豬苓生長土壤中的放線菌、酵母菌和細(xì)菌比自然土壤低1個數(shù)量級。豬苓生長土壤中纖維素分解菌和固氮菌菌落數(shù)顯著高于自然土壤，可能與豬苓生長土壤腐殖質(zhì)層較厚，土壤肥力較好，土質(zhì)疏松有關(guān)。

2.4 豬苓生長土壤與自然土壤中霉菌的比較

霉菌遍布于全世界，大多數(shù)棲息于土壤、水體和植物載體上，對土壤和生命體發(fā)揮著非常重要的作用。由于霉菌種類多、形態(tài)多樣、特征各異、容易觀察鑒別，并且分離純化出霉菌中各菌屬對研究霉菌作用有很大的幫助。本次試驗從豬苓土壤和自然土壤中各自分離純化已知的霉菌5株，分別為青霉屬、交鏈孢霉屬、毛霉屬、根霉屬、曲霉屬，還有未確定的其他霉菌，見圖1。

豬苓生長土壤和自然土壤中，青霉數(shù)量最多，每克土壤中數(shù)量分別達(dá)到 8.17 ×104cfu·g－1和 4.07 ×104cfu·g－1，占總霉菌數(shù)量的41.47%和55.52%。接著依次是交鏈孢霉、毛霉、根霉、曲霉，豬苓土壤中數(shù)量分別為2.97×104cfu·g－1、1.93 ×104cfu·g－1、1.33 × 104cfu·g－1、0.13 × 104cfu·g－1，自然土壤中數(shù)量分別為1.7 ×104cfu·g－1、0.33 ×104cfu·g－1、0.37 ×104cfu·g－1、0.1 ×104cfu·g－1，未知霉菌在豬苓土壤和自然土壤中數(shù)量分別為1.13×104cfu·g－1和1.13×104cfu·g－1。即從總體說，豬苓生長土壤中霉菌各菌株數(shù)量都高于自然土壤，并且青霉和毛霉的數(shù)量明顯高于自然土壤。

3 討論

根際微生物是土壤生命活動的重要組成成分，是根際微環(huán)境與土壤有機物質(zhì)相互循環(huán)和相互轉(zhuǎn)換的紐帶，對植物的生長發(fā)育起著重要作用，更對其周圍的寄生生物也發(fā)揮著重要影響。豬苓生長土壤中纖維素分解菌數(shù)量較多，該菌能分解纖維素為葡萄糖，葡萄糖可以為豬苓生長提供碳源。豬苓生長土壤中霉菌數(shù)量較多，可使土質(zhì)肥沃、透氣性良好，為豬苓生長創(chuàng)造了良好的條件。豬苓生長土壤中固氮菌的數(shù)量也較多，這可能是大量的固氮菌能為豬苓的生長提供氮源[16]。豬苓生長土壤中放線菌的數(shù)量明顯比自然土壤中的少，可能與其土壤為微酸性[17]有關(guān)，不適宜放線菌生長繁殖。豬苓生長土壤中酵母菌的數(shù)量較少，其作用可能是防止酵母菌在厭氧條件下促進(jìn)土壤中的糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酸，不利于豬苓中多糖類物質(zhì)的合成。

豬苓生長土壤中霉菌是一個很大的類群，而霉菌中青霉屬在豬苓土壤中占了很大的比例，青霉可以分解土壤中其他微生物難以分解利用的有機物和營養(yǎng)成分，對土壤環(huán)境具有高度的適應(yīng)性和改良性，在土壤中發(fā)揮著重要意義。而且，青霉能與其他微生物形成穩(wěn)定的微生物群落，可以阻擋病原菌微生物的入侵，對土壤特定環(huán)境起到一定的屏障和防治作用。因此，青霉很可能與豬苓生長土壤的獨特性有關(guān)。還有，毛霉、根霉、交鏈孢霉的數(shù)量比自然土壤也明顯增多，他們都可參與大分子物質(zhì)的分解，釋放營養(yǎng)元素、提高土壤肥力、改善土壤結(jié)構(gòu)，也可能對豬苓生長土壤成分發(fā)揮一定作用，對豬苓品質(zhì)改良有積極影響。

4 結(jié)論

豬苓生長土壤中微生物的分布和數(shù)量具有一定的特殊性，纖維素分解菌、固氮菌和霉菌 (尤其是青霉屬)數(shù)量顯著增多，可能決定著豬苓土壤資源的珍稀性。而且，豬苓生長土壤中合理的微生物比例，對豬苓人工種植、提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)具有一定的積極意義，因此，可以通過人工配制微生物菌劑，可以為優(yōu)質(zhì)豬苓的大面積栽培提供菌肥。

[1]李梁，羅英，熊東紅，等.野生豬苓及其生態(tài)環(huán)境理化特性的分析研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2001(7):32－33.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中草藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986:2191－2192.

[3]趙英永，崔秀明，張文斌.豬苓的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2009(11):1785－1786.

[4]張志剛，楊權(quán)社，楊金梅.隴南豬苓規(guī)范化栽培技術(shù)[J].食用菌，2011(2):42.

[5]李富得，楊燕.隴南山區(qū)豬苓仿野生優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)規(guī)范化栽培技術(shù)[J].食用菌，2012(3):40－41.

[6]曹琴.隴南豬苓人工栽培技術(shù) [J].中國食用菌，2010，29(2):69－70.

[7]郭順星，徐錦堂.豬苓菌核的營養(yǎng)來源及其與蜜環(huán)菌的關(guān)系[J].植物學(xué)報，1992，34(8):576－580.

[8]徐錦堂，郭順星.豬苓與蜜環(huán)菌的關(guān)系[J].真菌學(xué)報，1992，11(2):142－145.

[9]王秋穎，徐錦堂，等.豬苓與蜜環(huán)菌營養(yǎng)關(guān)系的初步探討 [J].中國中藥雜志，2000，25(8):472.

[10]許廣波，博偉杰，趙旭奎.我國豬苓研究的進(jìn)展 [J].菌物研究，2003(1):58－61.

[11]李富得.豬苓菌核半野生栽培技術(shù) [J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2012(5):58－59.

[12]宋欽蘭.豬苓的藥理研究及臨床應(yīng)用[J].廣西中醫(yī)藥，1981(3):42－45.

[13]劉漢卿，郭勇全，肖萍，等.豬苓的研究與應(yīng)用[J].廣州化工，2010，38(10):40－41.

[14]周德慶，胡寶龍，祖若夫，等.微生物學(xué)實驗教程 [M].北京:高等教育出版社，2006(2):372－375.

[15]李阜棣，喻子牛.農(nóng)業(yè)微生物實驗技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[16]朱祖祥.土壤學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1982:36－38.

[17]羅英，李梁.豬苓生長的土壤條件研究[J].核學(xué)農(nóng)報，2002(2):115－118.