韓蘭秀，林江，徐昕，錢軍，周劍波，王雅麗

（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院實驗室，江蘇江陰214400）

建立RQ-PCR方法檢測急性早幼粒細胞白血病患者6種不同PML／RARα異構(gòu)體

韓蘭秀1，2，林江1，徐昕2，錢軍1，周劍波2，王雅麗1

（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇鎮(zhèn)江212002；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院實驗室，江蘇江陰214400）

目的：建立檢測急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者PML／RARα融合基因6種特異性異構(gòu)體（bcr1／2、P4R3、P46R3、bcr3及P2R3）的實時定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)，并評價其特異性。方法：設(shè)計不同異構(gòu)體的特異性引物和探針，建立異構(gòu)體特異性RQ-PCR方法對6種特異性異構(gòu)體PML／RARα陽性模板進行擴增，評價異構(gòu)體定量檢測的特異性，并檢測10例APL患者中不同異構(gòu)體的含量。結(jié)果：所建立的各異構(gòu)體特異性RQ-PCR法最大敏感性均達10拷貝／μL，但其重復(fù)性較差，108～102拷貝／μL陽性模板的重復(fù)性良好，正常對照及空白對照無擴增信號，每個異構(gòu)體特異性RQ-PCR均不能擴增其他異構(gòu)體。5例長型（bcr1）和1例變異型（bcr2）陽性APL患者中bcr1／2異構(gòu)體表達量為7.71%～89.71%（中位數(shù)13.70%），P4R3異構(gòu)體表達量為0.71%～16.26%（中位數(shù)4.48%），P46R3異構(gòu)體表達量為3.57%～14.09%（中位數(shù)6.33%）。4例短型（bcr3）患者中bcr3異構(gòu)體表達量為21.43%～197.04%（中位數(shù)100.69%），P2R3異構(gòu)體表達量為0.34%～9.07%（中位數(shù)2.45%）。1例短型患者經(jīng)誘導(dǎo)治療緩解后bcr3和P2R3異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄本明顯下降，復(fù)發(fā)時又明顯升高。結(jié)論：檢測PML／RARα異構(gòu)體特異性RQ-PCR方法敏感、可靠，可用于APL患者不同異構(gòu)體的定量檢測和微小殘留病灶的隨訪監(jiān)測。

聚合酶鏈反應(yīng)；急性早幼粒細胞白血病；PML／RARα；異構(gòu)體

急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性髓系白血病中的一個特殊亞型，約占10%。90%以上APL患者具有特征性的染色體易位t（15；17）（q22；q12-21），導(dǎo)致融合基因PML／RARα形成，編碼PML／RARα融合蛋白，從而導(dǎo)致粒細胞發(fā)育受阻于早幼粒細胞階段。根據(jù)PML基因斷裂位點的改變，主要產(chǎn)生3種不同的異構(gòu)體融合基因：長型（bcr1）、短型（bcr3）和變異型（bcr2）。Pandolfi等［1］在1992年即發(fā)現(xiàn)長型和變異型PML／RARα陽性的患者中同時存在PML外顯子4和RARα外顯子3重排（P4R3），導(dǎo)致終止密碼子在RARα外顯子3中提前出現(xiàn)，可能編碼一個異常的截斷PML蛋白，短型患者同時存在PML外顯子2和RARα外顯子3重排（P2R3），也導(dǎo)致終止密碼子在RARα外顯子3中提前出現(xiàn)，其后國內(nèi)外一直未有相關(guān)研究。目前APL患者中不同PML／RARα異構(gòu)體共表達的臨床意義不明。我們同時設(shè)計了bcr1／2、P4R3、P46R3、bcr3和P2R3等6種轉(zhuǎn)錄本的特異性引物，建立了異構(gòu)體特異性實時定量PCR（RQ-PCR）檢測方法，并對10例APL患者的凍存樣本進行了檢測，證明了該方法的可行性。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源

10例初診APL患者均為本院住院病例，診斷按文獻［2］，染色體核型分析均為t（15；17）陽性，且均經(jīng)RQ-PCR［3］驗證。其中5例患者為長型PML／RARα陽性，1例患者為變異型PML／RARα陽性，4例為短型PML／RARα陽性。陽性對照選用NB4細胞株，正常對照取自血常規(guī)正常的10例胸外科腫瘤患者的肋骨骨髓。

1.2 細胞分離、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

每例患者均于初診時抽取肝素抗凝骨髓標(biāo)本2 mL，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞（MNC），Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀定量，取RNA 2.0μg應(yīng)用6隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，反應(yīng)體系為40μL，含MMLV反轉(zhuǎn)錄酶200 U、dNTP（每種0.5 mmol／L）、10 mmol／L DTT、25 U RNA酶抑制劑，于37℃反轉(zhuǎn)錄1 h、95℃5 min滅活，cDNA儲存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RQ-PCR引物、探針的合成及陽性模板的制備

利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性異構(gòu)體的上游引物，其中bcr1／2的上游引物設(shè)計在PML第5外顯子上，可以同時擴增bcr1和bcr2異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄本，共用下游引物和探針來自“歐洲抗癌計劃”［4］。引物和探針均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。見表1。

表1 不同PM L／RARα異構(gòu)體特異性RQ-PCR的引物和探針序列

分別應(yīng)用5種異構(gòu)體特異性RQ-PCR擴增長型和短型APL患者的cDNA標(biāo)本，得到相應(yīng)的擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物純化，連接到PGEM-T載體（美國Promega公司），再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中。利用藍白斑篩選挑取白色陽性菌落克隆，經(jīng)上?；瞪锛夹g(shù)公司測序鑒定后進行質(zhì)粒抽提、定量，最后從108拷貝／μL開始進行10倍稀釋建立陽性模板梯度，置于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RQ-PCR檢測患者PML／RARα融合基因異構(gòu)體含量

PCR反應(yīng)體系為25μL，含10×緩沖液2.5μL、MgCl24.0 mmol／L、dNTPs 0.2 mmol／L、引物0.5 μmol／L、探針0.2μmol／L、Taq酶1.0 U、50×ROX 0.5μL和cDNA 50 ng。反應(yīng)在7300擴增儀（ABI公司）上進行，95℃預(yù)變性5min，然后94℃15 s、60℃1 min，共45個循環(huán)。擴增儀利用電荷偶聯(lián)裝置（CCD）照相機每隔7秒實時檢測一次釋出的熒光信號，最后應(yīng)用SDS 1.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。為了保證檢測結(jié)果的特異性和可信性，該RQ-PCR方法檢測患者cDNA時均附帶了不同濃度的陽性模板cDNA，正常對照cDNA和空白對照（NTC）。應(yīng)用看家基因ABL作為內(nèi)參照［3］。PML／RARα轉(zhuǎn)錄本的絕對量表示為每50 ng總RNA中含有的拷貝數(shù)，而每個患者中PML／RARα轉(zhuǎn)錄本的值則以相對量表示（NPML／RARα＝PML／RARα轉(zhuǎn)錄本的拷貝數(shù)／ABL拷貝數(shù)×100%）。

1.5 不同異構(gòu)體定量檢測的特異性評價

用每種特異性異構(gòu)體RQ-PCR反應(yīng)體系擴增其他異構(gòu)體的陽性模板，評價異構(gòu)體間定量檢測的特異性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 10.0軟件包進行相關(guān)中位數(shù)統(tǒng)計處理。不同濃度PML／RARα融合基因異構(gòu)體重復(fù)6次的檢測結(jié)果采用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 RQ-PCR方法的敏感性、重復(fù)性、特異性

應(yīng)用不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準品所建立的5組標(biāo)準曲線（圖1）均達到了良好的敏感性、重復(fù)性和特異性。最大敏感度均達到10拷貝／μL，但10拷貝／μL的重復(fù)性不好，而108～102拷貝／μL重復(fù)性良好（表2）。10例正常對照及空白對照無任何陽性信號擴增。標(biāo)準曲線的相關(guān)參數(shù)見表3。

圖1 不同濃度PM L／RARα異構(gòu)體重組質(zhì)粒RQ-PCR的熒光擴增結(jié)果及其標(biāo)準曲線

表2 不同濃度PML／RARα融合基因異構(gòu)體檢測結(jié)果

表3 PM L／RARα融合基因異構(gòu)體標(biāo)準曲線的相關(guān)系數(shù)

2.2 不同異構(gòu)體RQ-PCR定量檢測的特異性

每個異構(gòu)體RQ-PCR體系只能擴增相應(yīng)的特異性異構(gòu)體陽性模板，對其他特異性異構(gòu)體的陽性模板均無擴增。

2.3 初診APL患者中PML／RARα特異性異構(gòu)體轉(zhuǎn)錄本含量

6例長型或變異型APL患者中bcr1／2異構(gòu)體相對定量為7.71%～89.71%（中位數(shù)13.70%），P4R3異構(gòu)體相對含量為0.71%～16.26%（中位數(shù)4.48%），P46R3相對含量為3.57%～14.09%（中位數(shù)6.33%）。4例短型患者中bcr3異構(gòu)體相對含量為21.43%～197.04%（中位數(shù)100.69%），P2R3異構(gòu)體相對含量為0.34%～9.07%（中位數(shù)2.45%）。見表4。

表4 10例APL患者各種PM L／RARα融合基因異構(gòu)體檢測結(jié)果

2.4 10例APL患者的隨訪監(jiān)測

我們對10例APL患者的凍存樣本進行了隨訪監(jiān)測，截止到隨訪結(jié)束，僅有1例短型APL患者復(fù)發(fā)并死亡，其余9例患者均處于完全緩解期。死亡的1例患者在復(fù)發(fā)后4個月死于化療后骨髓抑制伴敗血癥。

3 討論

以往對APL等白血病的診斷及微小殘留病灶的監(jiān)測主要有細胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、Nouthern印跡、定性（半定量）PCR等技術(shù)。RQ-PCR技術(shù)具有快速、特異、敏感性高、可定量等優(yōu)點，在臨床上的應(yīng)用日益廣泛，然而，應(yīng)用RQPCR方法來檢測APL患者的PML／RARα融合基因6種異構(gòu)體的研究卻很少見。

由于目前國內(nèi)外所應(yīng)用的幾種RQ-PCR引物缺乏異構(gòu)體特異性，在同一反應(yīng)體系中能同時擴增幾種異構(gòu)體，多為不同異構(gòu)體的共同表達水平，無法提供每一異構(gòu)體的各自轉(zhuǎn)錄水平，因此，檢測結(jié)果提供的定量信息不準確，降低了對APL患者的預(yù)后評價和微小殘留病灶監(jiān)測的效用。為此，我們設(shè)計了PML／RARα融合基因不同異構(gòu)體的特異性引物，成功建立了6種異構(gòu)體的特異性定量檢測方法。該方法的建立具有如下意義：①可以精確定量PML／RARα融合基因中各異構(gòu)體的相對含量，便于異構(gòu)體間含量的比較；②為探討初診APL患者PML／ RARα融合基因各異構(gòu)體含量的臨床意義提供了方法學(xué)保證；③可以動態(tài)監(jiān)測異構(gòu)體含量變化，判斷其在預(yù)測患者復(fù)發(fā)中的作用。1例短型復(fù)發(fā)患者凍存標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，在患者發(fā)生血液學(xué)復(fù)發(fā)前，其特異性短型和P2R3異構(gòu)體含量均增高，證實了異構(gòu)體監(jiān)測在提示臨床復(fù)發(fā)中的作用。雖然幾個PML／RARα異構(gòu)體已被發(fā)現(xiàn)多年，但其病理意義尚未完全明了。許多臨床和實驗研究均集中于3個常見的異構(gòu)體（bcr1、bcr2和bcr3），并證實了其在APL中的致病機理以及在預(yù)后評價和微小殘留病灶檢測中的作用［5－6］。而對于P4R3、P46R3及P2R3等異構(gòu)體的研究仍處于探索階段。Ashur-Fabian等［7］發(fā)現(xiàn)長型APL患者經(jīng)治療后當(dāng)熒光原位雜交檢測轉(zhuǎn)陰時，34例患者中有9例RTPCR仍可檢出P46R3轉(zhuǎn)錄本，其中5例患者在隨訪過程中復(fù)發(fā)。最近又有報道顯示轉(zhuǎn)染了P4R3異構(gòu)體的U937細胞株對于全反式維甲酸的敏感性低于P46R3和bcr1［8］。

我們所建立的異構(gòu)體特異性RQ-PCR方法特異、敏感、可靠，可以對PML／RARα融合基因異構(gòu)體進行定量檢測。我們將進一步擴大病例進行檢測，以進一步明確不同異構(gòu)體的臨床意義。

［1］Pandolfi PP，Alcalay M，F(xiàn)agioliM，etal.Genomic variability and alternative splicing generatemultiple PML／RARαtranscripts thatencode aberrant PML proteins and PML／RARαisoforms in acute promyelocytic leukaemia［J］.EMBO J，1992，11（4）：1397－1407.

［2］張之南，沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準［M］.3版.北京：科學(xué)出版社，2007：106－206.

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［4］Gabert J，Beillard E，van der Velden VH，et al.Standardization and quality control studies of′real-time′quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia-a Europe Against Cancer Program［J］.Leukemia，2003，17（12）：2318－2357.

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Quantification of six different PM L／RARαisoform s in patients w ith acute prom yelocytic leukem ia using quantitative real time PCR

HAN Lan-xiu1，2，LIN Jiang1，XU Xin2，QIAN Jun1，ZHOU Jian-bo2，WANG Ya-li1
（1.Department of Hematology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.Department of Laboratory，the Affiliated Jiangyin Hospital，College of Medicine，Southeast University，Jiangyin Jiangsu 214400，China）

Objective：To establish a quantitative real time PCR（RQ-PCR）method for detecting the six different PML／RARαisoforms（bcr1／2，P4R3，P46R3，bcr3，P2R3）in acute promyelocytic leukemia（APL）patients，and evaluate the specificity of isoform-specific RQ-PCR.M ethods：Specific primers and probe of different isoforms were designed and isoform-specific RQ-PCR method for detecting each isoform was established.To evaluate the utility of this assay，bonemarrow samples from 10 APL patientswere detected.Results：In repeated tests，maximal sensitivity of 10 copies／μL for each isoform-specific RQ-PCR was obtained，however，the reproduciblemaximal sensitivities achieved 100 copies／μL.In the normal controls and the no-template control，any amplified fluorescent signalswere not detected.Each isoform-specific RQ-PCR could not amplify other isoforms.In five bcr1-positive cases and one bcr2-positive case，the expression level of bcr1／2，P4R3 and P46R3 isoformswas7.71%－89.71%（median 13.70%），0.71%－16.26%（median 4.48%），3.57%－14.09%（median 6.33%），respectively.In four bcr3-positive cases，the expression level of bcr3 and P2R3 isoforms was 21.43%－197.04%（median 100.69%）and 0.34%－9.07%（median 2.45%）.The expression level of bcr3 and P2R3 isoforms significantly de-creased in one case achieving complete remission after induction therapy compared to that in initial diagnosis，and significantly increased after relapse.Conclusion：Isoform-specific RQ-PCR method for six PML／RARαisoformswas a sensitive，reliable quantitative assay and could be used in the detection of the six different PM／RARαisoforms of APL and themeasurement ofminimal residual disease.

polymerase chain reaction；acute promyelocytic leukemia；PML／RARα；isoform

R783.5

A

1671－7783（2014）04－0324－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140135

江蘇省醫(yī)學(xué)重點人才資助項目（RC2007035）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK2009206）；鎮(zhèn)江市社會發(fā)展項目（SH2008041）

韓蘭秀（1981—），女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中心實驗室的管理和實驗操作；錢軍（通訊作者）主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：qianjun0007＠sina.com

2014－05－22 ［編輯］陳海林