周正斌，周瑞，黃震，曹鵬，成宏偉

（泰興市人民醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.病理科，江蘇泰興225400）

生存素和Caspase-3蛋白在食管癌前病變及癌組織中的表達(dá)及意義

周正斌1，周瑞1，黃震1，曹鵬2，成宏偉1

（泰興市人民醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.病理科，江蘇泰興225400）

目的：探討食管癌前病變及癌組織中生存素和Caspase-3蛋白的表達(dá)及其意義。方法：用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)63例食管癌（食管癌組）、86例食管鱗狀上皮不典型增生（包含輕度、中度、重度）患者（不典型增生組）和40例正常食管黏膜（正常黏膜組）組織中生存素和Caspase-3蛋白的表達(dá)，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。分析這兩類蛋白表達(dá)與食管癌臨床分期的關(guān)系。結(jié)果：在正常黏膜組、不典型增生組和食管癌組中生存素的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01），而Caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率則逐漸減弱（rs＝－0.687，P＜0.05）。在食管癌組，生存素表達(dá)與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及臨床分期（Ⅰ＋Ⅱ期／Ⅲ＋Ⅳ期）相關(guān)（P＜0.01）；Caspase-3表達(dá)與食管癌分化程度相關(guān)（P＜0.01）；生存素的陽(yáng)性表達(dá)率與Caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.897，P＜0.01）。結(jié)論：生存素和Caspase-3蛋白的異常表達(dá)可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為食管癌早期診斷及判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

食管癌；癌前病變；生存素；Caspase-3；不典型增生

食管癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在我國(guó)其發(fā)病率和病死率居世界首位。由于發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制尚未完全闡明，故眾多學(xué)者仍致力于尋找食管腫瘤發(fā)生、發(fā)展的原因，以求找到治療的靶標(biāo)。分子生物學(xué)的發(fā)展顯示，食管癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程涉及多個(gè)基因的改變，是多個(gè)基因協(xié)同作用的結(jié)果。細(xì)胞凋亡存在于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，而且與腫瘤的血管生成、轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系，影響腫瘤預(yù)后。生存素是凋亡抑制蛋白家族成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子。Caspase-3是引發(fā)細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心蛋白酶。為此，我們采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)食管癌前病變及癌組織中生存素、Caspase-3蛋白的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集我院2011年4月至2013年4月，86例胃鏡病理診斷為食管黏膜不典型增生的患者相應(yīng)組織標(biāo)本（不典型增生組），其中，男58例，女28例，年齡32～79歲，平均（39.7±2.3）歲；輕度不典型增生29例，中度31例，重度26例。63例食管癌病例（食管癌組）中，男41例，女22例，年齡35～77歲，平均（40.3±3.1）歲；結(jié)合超聲、CT、全身骨放射性核素掃描、PET-CT及術(shù)后病理等，按腫瘤分化程度分類：低分化36例，中＋高分化27例；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：T1＋T215例，T3＋T448例；臨床分期：Ⅰ＋Ⅱ期38例，Ⅲ＋Ⅳ期25例；淋巴轉(zhuǎn)移39例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移24例。取同期正常食管黏膜組織40例（正常黏膜組），其中，男27例，女13例，年齡33～76歲，平均（36.9±2.9）歲。3組性別及年齡間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有標(biāo)本取材前患者均未經(jīng)放療或化療，均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 mm厚連續(xù)切片。

1.2 試劑

生存素和Caspase-3 IgG多抗為Newmarker公司產(chǎn)品，免疫組化SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 生存素和Caspase-3的檢測(cè)

免疫組織化學(xué)染色采用鏈菌素親生物素-過(guò)氧化物酶（SP）法。將組織切片置60℃恒溫箱烘烤30 min后37℃過(guò)夜，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)及蘇木素-伊紅（HE）染色。HE染色按常規(guī)進(jìn)行，光鏡下觀察結(jié)果，進(jìn)行病理分級(jí)、分期診斷，并與免疫組織化學(xué)結(jié)果對(duì)照觀察。SP法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將已知的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組織化學(xué)結(jié)果采用二級(jí)記分法。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍（400×）視野，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度分別評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強(qiáng)度分為4級(jí)：無(wú)染色為0分，淡黃色（弱陽(yáng)性）為1分，棕黃色（中等陽(yáng)性）為2分，棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）為3分。根據(jù)兩者積分乘積判斷：0分為無(wú)表達(dá)（－），l～3分為可疑表達(dá)（±），4～6分為表達(dá)（＋），7～12分為強(qiáng)表達(dá)（＋＋）。最終統(tǒng)計(jì)時(shí)將0～3分合并定為近乎無(wú)表達(dá)。結(jié)果判定由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立完成，取2人的平均值作為最終結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)使用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，兩變量之間采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同食管組織中生存素和Caspase-3的表達(dá)

生存素和Caspase-3的免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物呈黃色細(xì)顆粒狀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。生存素在正常食管黏膜內(nèi)無(wú)表達(dá)；在不典型增生組中25例表達(dá)陽(yáng)性（29.07%）；食管癌組織中45例表達(dá)陽(yáng)性（71.43%）。Caspase-3在正常食管黏膜中33例表達(dá)陽(yáng)性（82.50%）；在不典型增生組中55例表達(dá)陽(yáng)性（63.95%）；食管癌組織中21例表達(dá)陽(yáng)性（33.33%）。從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織，生存素表達(dá)逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01），Caspase-3表達(dá)逐漸減弱（rs＝－0.687，P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表1。

2.2 生存素和Caspase-3表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

食管癌低分化組與中高分化組中生存素的陽(yáng)性表達(dá)率間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；生存素在食管癌T分期間的表達(dá)亦無(wú)明顯差異（P＞0.05）。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組生存素陽(yáng)性表達(dá)率低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2＝13.405，P＜0.01）；臨床分期Ⅰ＋Ⅱ期陽(yáng)性表達(dá)率低于Ⅲ＋Ⅳ期（χ2＝18.115，P＜0.01）。Caspase-3在食管癌低分化組陽(yáng)性表達(dá)率低于中高分化組（χ2＝11.433，P＜0.01）；T1＋T2組與T3＋T4組（χ2＝0.127，P＞0.05）、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2＝0.269，P＞0.05）、臨床分期Ⅰ＋Ⅱ期與Ⅲ＋Ⅳ期（χ2＝0.119，P＞0.05）之間比較，Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

圖1 生存素和Caspase-3在各組標(biāo)本中的表達(dá)（SP法×400）

表1 不同食管組織中生存素和Caspae-3的陽(yáng)性表達(dá)率

表2 生存素、Caspase-3表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 食管癌組織中生存素、Caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

63例食管癌組織中，13例生存素表達(dá)“＋”，其中7例Caspase-3表達(dá)“－”、5例“＋”、1例“＋＋”；32例生存素表達(dá)“＋＋”，其中30例Caspase-3表達(dá)“－”、1例“＋”、1例“＋＋”。生存素與Caspase-3兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.897，P＜0.01）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因、多階段的過(guò)程。上皮細(xì)胞異常增生是食管癌易患人群最早期的變化，表現(xiàn)為基底細(xì)胞過(guò)度增生、間變和原位癌，是食管的癌前病變。在分子水平上，癌變涉及眾多原癌基因、抑癌基因以及蛋白質(zhì)的改變。直接或間接抑制細(xì)胞增殖、癌變的基因，稱為抑癌基因。各種致癌因素的共同作用導(dǎo)致原癌基因的啟動(dòng)和抑癌基因的失活，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）家族中相對(duì)分子質(zhì)量最小的一個(gè)，具有抑制細(xì)胞凋亡與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期兩種功能。正常情況下生存素僅表達(dá)于胚胎及分化不成熟的組織，而在成年人終末分化組織中并無(wú)表達(dá)，病理情況下會(huì)表達(dá)于大多數(shù)惡性腫瘤［1－2］，提示生存素在腫瘤的發(fā)生中可能具有重要作用。本研究中，從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織，生存素表達(dá)逐漸升高（rs＝0.732，P＜0.01）。結(jié)果表明，食管在癌變過(guò)程中生存素表達(dá)上調(diào)，可能使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)，逃避凋亡，細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤的形成。生存素基因的過(guò)度表達(dá)可能是食管癌發(fā)生中較早期出現(xiàn)的分子異常事件，可作為判斷食管癌生物學(xué)行為的一個(gè)指標(biāo)。本研究中，生存素在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，臨床分期Ⅲ＋Ⅳ期組的表達(dá)率明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期（P＜0.01），提示生存素表達(dá)與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及臨床分期（Ⅰ＋Ⅱ期／Ⅲ＋Ⅳ期）相關(guān)［3］。這說(shuō)明生存素可使食管癌惡性程度增加，侵襲力增強(qiáng)，使得腫瘤的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移更易發(fā)生［4］，因此生存素可作為食管癌預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物［5］。

Caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子啟動(dòng)Caspase家族引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，也是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。本研究中，Caspase-3的表達(dá)有從食管正常黏膜上皮→不典型增生（輕、中、重度）→食管癌組織逐漸減弱的趨勢(shì)（rs＝－0.687，P＜0.05），提示Caspase-3表達(dá)的喪失促進(jìn)了食管癌的發(fā)生。Caspase-3在食管癌低分化組中的表達(dá)明顯低于中高分化組（P＜0.01）。可見(jiàn)，Caspase-3表達(dá)與食管癌分化程度相關(guān)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Caspase-3表達(dá)與腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床分期無(wú)關(guān)。Caspase-3蛋白在食管癌中的低表達(dá)，以及與食管癌分化程度的關(guān)系，說(shuō)明Caspase-3表達(dá)的喪失有助于食管癌的形成，并且能夠預(yù)示其惡性程度，但與食管癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力關(guān)系不大。

已有研究發(fā)現(xiàn)，生存素通過(guò)抑制Caspase-3的活性，抑制細(xì)胞凋亡。其抑制機(jī)制可能為［6］①生存素直接影響Caspase-3的抗凋亡作用。②Fas和細(xì)胞增殖信號(hào)刺激生存素轉(zhuǎn)入細(xì)胞核與周期蛋白激酶CDK4結(jié)合，加快細(xì)胞由G1向S期轉(zhuǎn)換，同時(shí)抑制proCaspase-3激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用。③Thr34位點(diǎn)磷酸化的生存素與Caspases結(jié)合而發(fā)揮抗凋亡作用。④生存素可與線粒體釋放的第二個(gè)線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白（SMAC）結(jié)合，保護(hù)凋亡抑制蛋白（IAPs）中的X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）等，而發(fā)揮間接抑制作用。本研究結(jié)果提示，生存素可能通過(guò)抑制Caspase-3的活性，減低Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用，從而導(dǎo)致食管癌的發(fā)生。

綜上，生存素、Caspase-3可能協(xié)同參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)一步研究?jī)烧弑磉_(dá)與食管癌的關(guān)系，有助于了解食管癌的生物學(xué)行為，探索有效早期診斷的方法，判斷食管癌的預(yù)后［7］，并提供靶向治療的新途徑［8］。

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Expression and significance of survivin and Caspase-3 protein in esophageal precancerosis and cancer tissue

ZHOU Zheng-bin1，ZHOU Rui1，HUANG Zhen1，CAO Peng2，CHENG Hong-wei1
（1.Department of Gastroenterology，2.Department of Pathology，Taixing People′s Hospital，Taixing Jiangsu 225400，China）

Objective：To investigate the relationship between the expression of survivin and Caspase-3 protein and the biological behaviors of esophageal precancerosis and cancer tissue.M ethods：The expressions of survivin and Caspase-3 proteins in 63 esophageal cancer specimens，86 atypical hyperplasia specimens（include light，moderate and high grade hyperplasia），and 40 normal esophagealmucous specimens，were investigated with S-P immunohistochemical technique，and their correlation with pathologic characteristic，and clinical stages of esophageal cancerwere analyzed.Results：The positive expression rate of survivin protein showed higher trend（rs＝0.732，P＜0.01），while，that of Caspase-3 protein showed lower trend（rs＝－0.687，P＜0.05），from normal esophagealmucous，to light，moderate and high grade hyperplasia，and to esophageal cancer.In esophageal cancer tissue，the expression of survivin proteinswas positively correlated with the lymph nodemetastasis and clinical stages（P＜0.01），and that of Caspase-3 protein was positively correlated with the degree of differentiation（P＜0.01）.Moreover，therewas a negative association between the survivin and Caspase-3 protein expression（r＝－0.897，P＜0.01）.Conclusion：The expression of survivin and Caspase-3 may be significantly related to the occurrence and progression of esophageal carcinoma，and helpful in predicting the biological behavior and prognosis of esophageal cancer.

esophageal cancer；precancerosis；survivin；Caspase-3；atypical hyperplasia

R730.43

A

1671－7783（2014）04－0342－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140132

周正斌（1970—），男，江蘇泰興人，副主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的臨床診治。

2014－05－19 ［編輯］陳海林