葛會林,劉樹深,蘇冰霞(.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心,海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質量安全重點實驗室,海南 ?？?570；2.同濟大學環(huán)境科學與工程學院,長江水環(huán)境教育部重點實驗室,上海 200092)

通用濃度加和模型預測有機磷與三嗪農(nóng)藥對綠藻的聯(lián)合毒性

葛會林1,2,劉樹深2*,蘇冰霞1(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心,海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質量安全重點實驗室,海南 ?？?571101；2.同濟大學環(huán)境科學與工程學院,長江水環(huán)境教育部重點實驗室,上海 200092)

基于微板藻毒性試驗測定5個有機磷農(nóng)藥與4個三嗪類農(nóng)藥的單個及聯(lián)合毒性.根據(jù)半數(shù)效應濃度(EC50),對斜生柵藻96h生長抑制的毒性大小順序為:西草凈>阿特拉津>撲滅通>苯嗪草酮>草甘膦>敵敵畏>磷胺>乙酰甲胺磷>甲胺磷.這表明直接干擾光合作用電子傳輸?shù)娜撼輨┑脑宥拘悦黠@大于有機磷農(nóng)藥.以通用濃度加和作為參考模型,三嗪類農(nóng)藥按 EC50和 EC10(10%效應濃度)濃度比的混合物對斜生柵藻呈現(xiàn)加和毒性.有機磷農(nóng)藥按 EC50和 EC10濃度比的混合物在低濃度呈現(xiàn)加和毒性,在高濃度呈現(xiàn)協(xié)同毒性.有機磷與三嗪類農(nóng)藥按EC50和EC10濃度比的混合物在低濃度為加和毒性,在高濃度為協(xié)同毒性.

斜生柵藻；微板毒性試驗；有機磷農(nóng)藥；三嗪除草劑；通用濃度加和；協(xié)同作用

藻類是水體中的初級生產(chǎn)者,處于水生食物鏈的基礎環(huán)節(jié),它們可以制造氧氣和有機物,對水體生產(chǎn)力和水體污染的自凈作用具有重要意義,因此在評價廢水與化學品對水環(huán)境的影響時,都把藻類生長抑制試驗作為一項重要內容[1].三嗪除草劑是植物光合作用電子傳遞的特異抑制劑.有機磷殺蟲劑通過對乙酰膽堿酯酶的抑制對昆蟲產(chǎn)生毒性.一些農(nóng)藥如阿特拉津、馬拉硫磷和草甘膦等還能導致內分泌干擾效應如雌激素效應[2].研究表明除草劑與殺蟲劑混用能產(chǎn)生增毒作用.如酰胺類除草劑乙草胺或丁草胺與殺蟲劑三唑磷聯(lián)用對蚯蚓的致死毒性會產(chǎn)生增毒作用,阿特拉津能增加毒死蜱、甲基對硫磷和二嗪農(nóng)對伸展搖蚊的毒性,阿特拉津與特丁津能增加毒死蜱對溪流搖蚊和乙酰膽堿酯酶的毒性[3-5].由于各種農(nóng)藥的大量使用,使得不同種類的農(nóng)藥總是以混合物的形式而不是單獨存在于環(huán)境中,生物體有可能暴露于多種有機磷與三嗪農(nóng)藥的混合物[6],此時聯(lián)合毒性呈現(xiàn)何種作用模式需要進一步研究.因此,本研究選擇5個有機磷與4個三嗪農(nóng)藥組分,并以斜生柵藻作為指示生物,基于通用濃度加和(GCA)模型對其混合物毒性進行評估.

混合物毒性相互作用(加和、協(xié)同或拮抗)目前多是采用統(tǒng)計分析、模型參考或把兩者結合起來進行評估.參考模型一般包括等效線圖、毒性單位(TU)、相加指數(shù)(AI)、混合毒性指數(shù)(MTI)、相似性參數(shù)(λ)、濃度加和(CA)、獨立作用(IA)[7]及GCA等.等效線圖與TU一般認為是較早提出的基礎模型,現(xiàn)在可看作CA的特殊形式.AI、MTI與λ是基于TU的擴展模型.等效線圖只能進行圖形化定性評估,TU、AI、MTI與λ可進行數(shù)值化的定性評估.而CA、IA與GCA可進行混合物毒性的定量預測與定性評估.CA模型[式(1)]一般用于作用機制相似的化合物的聯(lián)合毒性預測;IA模型[式(2)]源于獨立事件概率公式,一般用于作用機制相異的化合物的混合物毒性預測[8].根據(jù)公式(1),CA無法預測超過組分抑制效應最小值的混合物效應[9].根據(jù)式(2),當效應超出 0～1范圍時,IA模型也將失去其概率含義而失效.CA與IA用于評估包括完全和部分激動劑的混合物效應[10]以及雌激素的混合物效應[11]時也存在類似的問題.GCA模型[式(3)]是CA的一種擴展形式,其主要優(yōu)勢在于可以預測處于 CA盲區(qū)的混合物效應.

式中:n是混合物的組分數(shù);ECχ,i為物質i單獨引起效應χ%時的濃度;pi是第i個組分在混合物中的濃度比例;E CCA為CA預測產(chǎn)生χ%效應的混χ,m ix合物濃度;Ei為物質i單獨引起的效應;EmIAix為IA預測的混合物效應;EmGiCxA為GCA預測的混合物效應;c為污染物濃度;α為最大值參數(shù);K為中值參數(shù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SpectraMax M5型酶標儀(美國 Molecular Devices公司),SW-CJ-IF型凈化工作室(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司),150C恒溫光照振蕩培養(yǎng)箱(金壇市億通電子有限公司),LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠),BT25S型五位電子天平(賽多利斯公司),PHS-25型數(shù)顯酸度計(上海天達儀器有限公司).微板選用96孔平底透明聚苯乙烯板(Corning 9018).

敵敵畏(CAS號62-73-7,純度99.5%)、草甘膦(CAS號 1071-83-6,純度 99.0%)、磷胺(CAS號 13171-21-6,純度 98.3%)、乙酰甲胺磷(CAS號 30560-19-1,純度 98.8%)、甲胺磷(CAS號10265-92-6,純度 99.5%)和苯嗪草酮(CAS號41394-05-2,純度99.5%)購買自Chem Service.西草凈(CAS號 1014-70-6,純度 99.2%)、撲滅通(CAS號 1610-18-0,純度 99.6%)和阿特拉津(CAS 號 1912-24-9,純度 97.4%)購買自Riedel-deHaen.受試9種農(nóng)藥的分子結構見圖1.

1.2 微板藻毒性試驗

受試生物斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(編號 FACHB-416),培養(yǎng)采用水生 4號(HB-4)綠藻通用培養(yǎng)基[12],其配方為(NH4)2?SO40.2g、MgSO4?7H2O 0.08g、NaHCO30.3g、Ca(H2PO4)20.03g、KCl 0.025g、1% FeCl30.15mL、土壤浸出液1mL和蒸餾水1000mL.微板藻毒性測試參考文獻[13]方法進行,微板棄用最外一圈,第2、6、7和11列共24孔加入100μL純水作空白對照,第3～5列與8～10列共36孔加入100μL的12個濃度并3次平行的單個農(nóng)藥或其混合物,最后向所有孔加入100μL處于對數(shù)生長期的藻液.微板放入培養(yǎng)箱中,設置光照度約3000lx,溫度 22oC,暴露 4d,每天同一時間于682nm波長處測定光密度(OD),測讀前振蕩 5s.單個農(nóng)藥進行 4塊微板測試,農(nóng)藥混合物進行 5塊微板測試.

圖1 受試農(nóng)藥的分子結構Fig.1 Molecular structure of the test pesticides

根據(jù)生物量法[1]計算污染物對藻的生長抑制毒性,由式(4)計算藻生長曲線在(t0,tj)時間范圍內所圍面積(A),根據(jù)空白組藻生長曲線所圍面積(Ac)與暴露組藻生長曲線所圍面積(At)按公式(5)計算藻生長抑制率(E).污染物對藻毒性的濃度-響應曲線(CRC)采用式(6)所示 Hill函數(shù)進行最小二乘擬合,其反函數(shù)[式(7)]用于計算與一定效應(χ%)對應的效應濃度(ECχ),擬合優(yōu)度通過決定系數(shù)(R2)進行評價.

式中:tj表示第j時刻所經(jīng)歷的時間;ODj表示第j時刻藻液光密度.

1.3 混合物實驗設計與毒性預測

根據(jù)單個農(nóng)藥效應濃度EC50和EC10,設計有機磷農(nóng)藥、三嗪類農(nóng)藥及兩者混合分別按 EC50和 EC10濃度比的混合物(分別命名為 M1和M2,M3和M4,M5和M6).參考文獻[10]將GCA模型拓展為式(8)所示的可用于多組分混合物的形式,基于單個組分的輸入?yún)?shù)(ci,αi,Ki),使用GCA模型計算其混合物的效應.當混合物實測毒性大于或小于 GCA預測毒性時,判斷混合物呈現(xiàn)協(xié)同或拮抗作用.

2 結果與討論

2.1 單個農(nóng)藥毒性

微板毒性分析法測得5個有機磷與4個三嗪農(nóng)藥對斜生柵藻的濃度-響應曲線如圖 2所示,采用Hill函數(shù)擬合得到相關參數(shù)及EC50與EC10見表1.以EC50作為標準,這9種農(nóng)藥對斜生柵藻的毒性從大到小為:西草凈 > 阿特拉津 > 撲滅通 > 苯嗪草酮 > 草甘膦 > 敵敵畏 > 磷胺 >乙酰甲胺磷 > 甲胺磷.這個順序與文獻[13]結果基本一致.甲胺磷EC50是西草凈的30萬倍,通過直接干擾光合作用的三嗪除草劑的毒性明顯大于有機磷農(nóng)藥的毒性,說明藻類對于除草劑比殺蟲劑更為敏感,保護水環(huán)境中的初級生產(chǎn)者時要特別注意控制除草劑如三嗪類.

圖2 單個農(nóng)藥對斜生柵藻生長抑制的濃度-響應曲線Fig.2 Concentration-response curves of single pesticides on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus●:實測點; —:Hill擬合線

由表1與圖2可見,敵敵畏、草甘膦與磷胺的最大值參數(shù)(α)大于1,最大抑制效應大于 1,通過分析可知是高濃度暴露組藻液OD減小之故,此時毒物濃度過高可能導致藻細胞死亡、分裂甚至溶解.乙酰甲胺磷、甲胺磷、苯嗪草酮、西草凈、撲滅通與阿特拉津的α小于1,其效應增加到一定程度時趨于穩(wěn)定,最大抑制效應小于 1,具體原因有待進一步研究.最大抑制率不能歸一化到 100%,這是本研究采用Hill函數(shù)進行CRC擬合的原因.需要指出當α固定為1進行擬合時,中值參數(shù)(K)將正好為EC50.

表1 單個農(nóng)藥及其混合物對斜生柵藻生長抑制的Hill濃度-響應模型和關鍵毒性指標Table 1 Hill concentration-response models of single pesticides and their mixtures on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus and key toxicity parameters

根據(jù)表 1,單個農(nóng)藥能引起的最大效應范圍是從甲胺磷的0.52到磷胺的1.84,這導致CA模型能預測混合物的最大效應為0.52,大于0.52的效應范圍為 CA預測盲區(qū).由于部分組分(敵敵畏、草甘膦、磷胺)的最大抑制效應大于1,IA不適合預測本研究中的混合物效應.因此,采用GCA模型進行聯(lián)合毒性預測,并作為聯(lián)合毒性評估的參考模型.

2.2 農(nóng)藥聯(lián)合毒性

由圖3可見,對于有機磷農(nóng)藥混合物(M1和M2)的聯(lián)合毒性,在效應小于50%的區(qū)域,GCA模型能對混合物CRC進行有效預測;而在效應大于50%的區(qū)域,混合物實測毒性高于GCA預測毒性,說明此時呈現(xiàn)協(xié)同毒性.王凌等[14]根據(jù) AI指數(shù)也發(fā)現(xiàn)甲基對硫磷和毒死蜱對中肋骨條藻的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用.有機磷農(nóng)藥之間的協(xié)同毒性在其他指示生物體系研究中也有報道.賈玉玲等

[15]根據(jù)共毒系數(shù)(CTC)、TU、AI和MTI發(fā)現(xiàn)乙酰甲胺磷、三唑磷、氧樂果、敵敵畏和敵百蟲的二元混合物對乙酰膽堿酯酶和發(fā)光菌的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用或部分相加作用.顏冬云等[16]根據(jù)CTC發(fā)現(xiàn)毒死蜱或甲胺磷與其他有機磷農(nóng)藥的二元混合物對乙酰膽堿酯酶的聯(lián)合毒性主要為協(xié)同作用.Moser等[17]基于統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)毒死蜱、二嗪農(nóng)、樂果、乙酰甲胺磷和馬拉硫磷能對大鼠產(chǎn)生協(xié)同的神經(jīng)毒性.

GCA模型可以有效預測三嗪混合物(M3和M4)的聯(lián)合毒性,三嗪除草劑對藻的聯(lián)合毒性呈現(xiàn)加和作用.Faust等[8]也發(fā)現(xiàn) 18種對稱三嗪除草劑對柵藻的聯(lián)合毒性可被 CA模型準確預測,屬于嚴格的相似作用物.王猛超等[18]將 CA模型拓展用于評估包含不同時間具有不同效應組分的嗪草酮、西草凈和環(huán)嗪酮的混合物對青海弧菌的聯(lián)合毒性,結果表明是加和作用,沒有協(xié)同或拮抗作用.三嗪除草劑屬于相似作用物,具有相同的毒性作用模式,即競爭性地置換光系統(tǒng)II反應中與D1多肽相結合的質體醌QB,從而導致電子傳遞受阻,所以對藻的聯(lián)合毒性為加和作用.

對于有機磷與三嗪農(nóng)藥混合物(M5和M6)的聯(lián)合毒性,在效應小于60%的區(qū)域,混合物CRC基本能被GCA預測;而在效應大于60%的區(qū)域,混合物實測毒性高于GCA預測毒性,說明此時有機磷與三嗪對藻的聯(lián)合毒性呈現(xiàn)協(xié)同作用.張小敏[19]也觀察到毒死蜱或馬拉硫磷與阿特拉津對假微型海鏈藻的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用.這可能是由于三嗪抑制藻的光合作用而影響藻細胞的正常生長和代謝,使綠藻更容易受到有機磷的攻擊;或者是有機磷破壞了藻的細胞膜結構,使三嗪更容易進入藻細胞所致.有機磷與三嗪的混合物對動物也能導致協(xié)同毒性.如Schuler等[20]通過對實測結果進行顯著性分析,發(fā)現(xiàn)阿特拉津、西瑪津和環(huán)嗪酮可以增強毒死蜱和二嗪農(nóng)對伸展搖蚊的毒性,在更高濃度時增強程度更大.Lydy等[21]基于 TU方法發(fā)現(xiàn)阿特拉津和氰草津能增加毒死蜱對赤子愛勝蚓的毒性,分析可能是由于阿特拉津的存在改變了毒死蜱的吸收和生物轉化.Pérez等[22]以IA作為參考模型,發(fā)現(xiàn)毒死蜱與阿特拉津或特丁津的二元混合物對生命早期階段的斑馬魚毒性呈現(xiàn)協(xié)同作用.所以,在環(huán)境風險評估中對于有機磷與三嗪農(nóng)藥的復合污染應當給予重點關注.

圖3 農(nóng)藥混合物對斜生柵藻生長抑制的濃度-響應曲線Fig.3 Concentration-response curves of pesticides mixtures on the growth inhibition of Scenedesmus obliquus●:實測點; -:Hill擬合線; ---:GCA預測線

3 結論

3.1 三嗪類農(nóng)藥對綠藻的毒性一般大于有機磷農(nóng)藥,本研究中甲胺磷EC50是西草凈的30萬倍,保護水環(huán)境中的初級生產(chǎn)者時要特別注意控制除草劑如三嗪類.

3.2 有機磷與三嗪類農(nóng)藥能導致協(xié)同毒性,在復合污染環(huán)境風險評估中應當給予關注.

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科學家發(fā)現(xiàn)北冰洋汞污染加劇

記者從中科院獲悉,我國科考人員乘坐“雪龍”號在海洋邊界層走航觀測中發(fā)現(xiàn)夏季北冰洋大氣汞循環(huán)的獨特現(xiàn)象,經(jīng)分析認為,夏季大氣化學過程將導致北冰洋汞污染加劇.

中科院所屬的中國科學技術大學極地環(huán)境研究室謝周清課題組一直依托我國極地破冰船“雪龍”號,建立船基海洋大氣環(huán)境化學觀測平臺,開展多次海洋邊界層走航觀測,發(fā)現(xiàn)北冰洋大氣汞呈現(xiàn)西高東低以及中心海冰區(qū)與開闊水域顯著不同等空間分布特征.通過進一步研究,科研人員發(fā)現(xiàn)這種變化與海冰融化和淡水輸入有關.

夏季隨海冰融化,一年或多年老冰中的汞進入水體,在太陽光和微生物的作用下,溶于水中的汞被還原再次釋放到大氣中,導致冰區(qū)大氣汞濃度高于開闊水域.另一方面,夏季環(huán)北冰洋特別是楚科奇海的河流攜帶高濃度的汞進入北冰洋,從而增加了海水中的溶解態(tài)汞.與此同時,河流帶入高濃度的有機溶解物增加了溶解態(tài)汞還原為零價氣態(tài)汞的能力,進而釋放到大氣中.

摘自中國環(huán)境網(wǎng)2014-08-21

Predicting joint toxicity of organophosphorus and triazine pesticides on green algae using the generalized concentration addition model

GE Hui-lin1,2, LIU Shu-shen2*, SU Bing-xia1(1.Hainan Provincial Key Laboratory of

Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables, Analysis and Testing Center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China；2.Key Laboratory of Yangtze Aquatic Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2413～2419

A microplate algae toxicity assay was performed to test the single and combined toxicities of five organophosphorus pesticides and four triazine herbicides. According to the median effect concentration (EC50), the toxicity effect on the 96h growth inhibition of Scenedesmus obliquus was in the following order: simetryn > atrazine > prometon > metamitron > glyphosate > dichlorvos > phosphamidon > acephate > methamidophos. This indicated that triazine herbicides inhibiting photosynthetic electron transport had greater toxicity than organophosphorus pesticides. The mixtures toxicities were evaluated by using generalized concentration addition (GCA) as the reference model. The mixtures of triazine herbicides in the ratios of EC50and EC10(10% effect concentration) presented additive toxicity on Scenedesmus obliquus. The mixtures of organophosphorus pesticides in the ratios of EC50and EC10presented additive toxicity in low concentration range and synergistic toxicity in high concentration range. The mixtures of organophosphorus and triazine pesticides in the ratios of EC50and EC10presented additive toxicity in low concentration range and synergistic toxicity in high concentration range.

Scenedesmus obliquus；microplate toxicity assay；organophosphorus pesticides；triazine herbicides；generalized concentration addition；synergism

X503.23

A

1000-6923(2014)09-2413-07

葛會林(1981-),男,山西晉城人,助理研究員,博士,主要從事復合污染毒理研究.發(fā)表論文10余篇.

2014-02-07

海南省自然科學基金(213027);國家自然科學基金(21177097)

* 責任作者, 教授,ssliuhl@263.net