夏許可，章 瑩

雪旺氏細(xì)胞作為外周神經(jīng)的膠質(zhì)細(xì)胞，主要參與髓鞘的構(gòu)成，并可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對外周神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育及神經(jīng)損傷后的修復(fù)具有重要作用[1-2]。原代培養(yǎng)是獲取雪旺氏細(xì)胞的重要手段[3]，本文介紹初生山羊坐骨神經(jīng)體外分離、培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞（圖1）的常用方法和技巧。

1 取材與保存

初生山羊體積較大，坐骨神經(jīng)較鼠類更為粗大，易于辨認(rèn)。麻醉后消毒，沿髖關(guān)節(jié)-腓骨小頭連線切開皮膚并分離皮下肌層，即可見坐骨神經(jīng)及脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)兩大分支。游離并切取長約4 cm的坐骨神經(jīng)束，即完成取材。山羊雪旺氏細(xì)胞活性明顯低于鼠類，且坐骨神經(jīng)束粗大，對缺氧環(huán)境耐受性差，取材后神經(jīng)束保存時間與接種后雪旺氏細(xì)胞成活率、產(chǎn)量關(guān)系密切，因此需要盡快行后期處理。若暫時不具備后期處理?xiàng)l件，宜將神經(jīng)束去除束膜后盡量剪碎并置于4℃預(yù)冷的DMEM-F12培養(yǎng)液中，于5 h內(nèi)完成接種。若將整條神經(jīng)束置于預(yù)冷培養(yǎng)液中保存，則后期接種成功率較低。取材過程中應(yīng)注意無菌，后期可應(yīng)用無菌PBS緩沖液多次沖洗神經(jīng)束以避免污染。

2 消化與接種

手術(shù)取出的神經(jīng)束置于超凈臺內(nèi)并剝離神經(jīng)外膜，減少接種后成纖維細(xì)胞的數(shù)量，增加雪旺氏細(xì)胞的純度。將神經(jīng)束置于培養(yǎng)皿內(nèi)并加入0.5 mL培養(yǎng)液，以無菌剪刀反復(fù)剪碎5～10 min，剪碎程度越高則越有利于雪旺氏細(xì)胞釋放，一般以無肉眼可見組織塊為標(biāo)準(zhǔn)。此步驟至關(guān)重要，直接關(guān)系到接種的成敗。

2.1 消化

常用的消化方法包括：①組織塊法：即剪碎后的組織不經(jīng)蛋白酶消化，直接接種于培養(yǎng)瓶中；②一次酶法：將剪碎后的組織塊以胰蛋白酶單次消化30～60 min，而后取上清細(xì)胞懸液接種；③二次酶法：將組織塊先以胰蛋白酶消化約10～15 min，離心沉淀后再次以胰蛋白酶或胰蛋白酶-膠原蛋白酶混合液消化10～15 min后接種，與一次酶法比較，此法對神經(jīng)束消化較為徹底，提高接種成功率，但較前兩者而言，二次酶法成本稍高，且酶消化時間較前兩者稍長，可能對細(xì)胞活性產(chǎn)生一定影響[4]。

2.2 接種

消化后即可離心取上層細(xì)胞懸液進(jìn)行接種，亦可直接取組織勻漿接種[5]。以加樣槍反復(fù)吹吸酶-組織勻漿混合液，離心后以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸沉淀并接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)。接種3～4 d后將漂浮的未貼壁組織塊轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中貼壁，原培養(yǎng)瓶中僅保留少量組織塊繼續(xù)貼壁。接種4～5 d可見新培養(yǎng)瓶中大量組織塊貼壁，其下方可見中等量強(qiáng)折光性細(xì)胞自組織塊中心向周圍爬行生長，細(xì)胞呈長梭形，兩端尖細(xì)，中部可見膨大細(xì)胞核；細(xì)胞呈“肩并肩”樣密集排布，有漩渦樣集落生成。另可見少量形狀不規(guī)則的細(xì)胞，多突起，核大居中，邊界不清，呈平鋪樣貼壁生長，符合成纖維細(xì)胞形態(tài)特征。與離心后取上清的接種法比較，不進(jìn)行離心而直接以夾雜組織塊的勻漿接種獲得雪旺細(xì)胞產(chǎn)量更優(yōu)，也更為穩(wěn)妥[6]。其原因包括：剪碎、消化過程意在為雪旺氏細(xì)胞暴露并脫離神經(jīng)束創(chuàng)造條件，但這一過程并不能保證產(chǎn)生足夠數(shù)量的游離雪旺氏細(xì)胞，單純以離心去沉淀上清液接種可能造成游離雪旺氏細(xì)胞數(shù)量不足、細(xì)胞密度過低，進(jìn)而導(dǎo)致接種失敗；如在接種時夾雜少量神經(jīng)組織塊，使雪旺氏細(xì)胞直接自組織塊爬行生長至培養(yǎng)瓶表面，則可大大增加雪旺氏細(xì)胞的接種成功率。此外，接種組織塊不宜過多，避免組織生長旺盛造成培養(yǎng)環(huán)境缺氧，雪旺氏細(xì)胞尚未貼壁即因缺氧導(dǎo)致死亡。

圖1 接種和傳代過程中雪旺氏細(xì)胞圖片（×200）

3 增殖與傳代

培養(yǎng)5～7 d可見培養(yǎng)瓶中雪旺氏細(xì)胞呈集落樣分布，局部較為密集，此時可加入少量胰蛋白酶消化，使培養(yǎng)瓶中部分雪旺氏細(xì)胞脫落，均勻分布瓶底后重新加入培養(yǎng)液終止消化。待細(xì)胞生長密集、密度增大后，適時進(jìn)行傳代。首先傾去培養(yǎng)液，以37℃預(yù)熱PBS緩沖液洗滌瓶內(nèi)細(xì)胞1～2次，后以3 mL胰蛋白酶室溫消化1 min，移至倒置相差顯微鏡下可見細(xì)胞邊界圓鈍、回縮，此時以吸管反復(fù)輕柔吹吸瓶底，使全部細(xì)胞脫落，懸液離心，并以培養(yǎng)基重懸底部沉淀后接種于2個培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。山羊雪旺氏細(xì)胞增殖速度較鼠類稍慢，貼壁后4～5 d可進(jìn)行傳代，7～8代后生長逐漸變緩，故應(yīng)及時凍存[7]。

4 凍存與復(fù)蘇

雪旺氏細(xì)胞生命力較為頑強(qiáng)，以常規(guī)細(xì)胞凍存方法保存即可，無特殊要求。凍存液由DMEM-F12、胎牛血清、二甲基亞砜以8∶1∶1體積比配制[8]。細(xì)胞凍存前一天換液，凍存當(dāng)日傾去瓶內(nèi)培養(yǎng)液，以胰蛋白酶消化全部細(xì)胞后離心，后以前述凍存液重懸底部沉淀，以凍存管存放于程序凍存盒，置于—80℃超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至—196℃液氮長期凍存。復(fù)蘇時將凍存管置入37℃水浴中快速融化后離心，以含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸沉淀并接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，隔日可見大量雪旺氏細(xì)胞貼壁生長，隔日換液后正常培養(yǎng)。

5 純化

目前，針對雪旺氏細(xì)胞的純化培養(yǎng)方法眾多，主要包括物理、化學(xué)、生物方法[3,9-11]。物理方法主要為差速貼壁法，利用雪旺氏細(xì)胞貼壁慢于成纖維細(xì)胞的特性，于傳代過程中先期收集首先消化下來的雪旺氏細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞全部消化后一次性接種，待2 h后大部分成纖維細(xì)胞已貼壁而雪旺氏細(xì)胞尚未貼壁這一臨界狀態(tài)出現(xiàn)時，將雪旺氏細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁培養(yǎng)，此法簡便易行，成本低，效果明顯；化學(xué)方法主要是利用化學(xué)試劑實(shí)現(xiàn)純化的目的，如使用Ara-c抗有絲分裂劑達(dá)到去除成纖維細(xì)胞的目的[12]；生物方法主要是應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行流式分選，此法特異性強(qiáng)，可獲得高純度雪旺氏細(xì)胞，但成本高、操作復(fù)雜，適用于取材、培養(yǎng)困難，細(xì)胞產(chǎn)量低的情況[13]。有研究顯示，當(dāng)雪旺氏細(xì)胞純度低于75%時，傳代后成纖維細(xì)胞很快成為優(yōu)勢細(xì)胞，此時應(yīng)用前述物理、化學(xué)方法純化雪旺氏細(xì)胞效果不佳[14]。

山羊雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)與鼠類相比難度稍大，在保證新鮮取材的基礎(chǔ)上細(xì)致操作、嚴(yán)格無菌觀念是成功的關(guān)鍵。同時，要注意到大型動物細(xì)胞活性較小型動物下降更快這一特性，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液并合理添加血清，及時凍存細(xì)胞，以保證實(shí)驗(yàn)的順利完成。

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