楊瀚春，王 榮，夏鵬霄，賈文超，楊長(zhǎng)勇

(1.解放軍第五一三醫(yī)院藥劑科，蘭州 732750；2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍臨床藥理基地，蘭州 730050； 3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000)

鎖陽亦稱不老藥，又名銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉，為鎖陽科植物鎖陽CynomoriumsongaricumRupr. 的干燥肉質(zhì)莖[1]，是一種不含葉綠素的全寄生植物，主要分布于我國西北的青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、寧夏等地區(qū)的半荒漠或荒漠地帶，尤其是甘肅河西走廊出產(chǎn)的鎖陽，因療效好而被歷代中醫(yī)認(rèn)為是鎖陽的道地藥材[2，3]。鎖陽性味甘溫，有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便之功效，用于腎陽不足、經(jīng)血虧虛、腰膝痿軟、陽痿滑精、腸燥便秘[4]。從鎖陽中分離出的成分有：有機(jī)酸、黃酮類、三萜類、甾體類、揮發(fā)性成分、氨基酸類、糖和糖苷類、鞣質(zhì)類、無機(jī)離子及花色苷、淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、還原糖等[5]。研究表明，鎖陽能夠促進(jìn)人體細(xì)胞再生和新陳代謝，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力，具防癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老的作用。其藥用機(jī)制主要體現(xiàn)在抗應(yīng)激作用，對(duì)免疫功能的影響，清除自由基，抗血小板聚集，類糖皮質(zhì)激素作用等。鎖陽的水提物可顯著增加機(jī)體的血紅蛋白含量，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗疲勞、抗缺氧能力[2]。鎖陽中含有的兒茶素(catechin)具有提高免疫功能、抗氧化等活性[6]；沒食子酸(gallic acid)具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用；原兒茶酸(protocatechic acid)具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量及祛痰、平喘、抗菌的作用。目前以HPLC 法同時(shí)測(cè)定鎖陽中兒茶素、沒食子酸和原兒茶酸的方法鮮有報(bào)道。本研究采用HPLC-DAD(二極管陣列檢測(cè)器)法建立了同時(shí)測(cè)定鎖陽提取物中兒茶素、沒食子酸和原兒茶酸的方法。該方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可為控制該藥材和飲片的內(nèi)在質(zhì)量提供參考依據(jù)，從而為鎖陽藥材資源的合理開發(fā)利用及提高臨床用藥質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀、Waters 996 photodiode Array Detector 二極管陣列檢測(cè)器、Millennium32 色譜工作站(美國Waters公司)；Metter AE240型電子天平(精度：0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司)；SK5200H超聲波儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Anke TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸對(duì)照品(批號(hào)依次為110877-200001、110831-200302、110809-200503，純度均≥98%，中國食品藥品檢定研究院)；鎖陽藥材及飲片(源自東風(fēng)場(chǎng)區(qū)、甘肅金塔、內(nèi)蒙古古日乃、內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗、烏魯木齊、蘭州)，均由蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志鋼教授鑒定為鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質(zhì)莖。乙腈 (色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；水為滅菌注射用水；其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備 (1)對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品兒茶素5.90 mg、沒食子酸 6.30 mg、原兒茶酸7.35 mg置同一個(gè)50 ml容量瓶中，加滅菌注射用水適量，超聲10 min使溶解，加水至刻度配制成含兒茶素0.118 mg/ml、沒食子酸0.126 mg/ml、原兒茶酸0.147 mg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，4 ℃冰箱保存待用。(2)供試品溶液 取鎖陽粉末(過40目篩)約2 g，精密稱定，置50 ml容量瓶中，精密加入滅菌注射用水10 ml，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，1.70×104×g離心5 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，置棕色瓶中，即得。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜條件：Hypersil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水-36%乙酸(8∶92∶0.1)；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：258.7 nm；柱溫：室溫。在此色譜條件下，將上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可見，沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素的出峰時(shí)間依次約為4.1、7.5、14.8 min，鎖陽中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 鎖陽的HPLC譜圖

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml，分別置于5 ml 容量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成含兒茶素2.36、4.72、9.44、18.88、37.76、75.52 μg/ml，含沒食子酸2.52、5.04、10.08、20.16、40.32、80.64 μg/ml，含原兒茶酸2.94、5.88、11.76、23.52、47.04、94.08 μg/ml的混合對(duì)照品系列溶液。依次取混合對(duì)照品系列溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液20 μl進(jìn)樣，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理。結(jié)果表明，兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸分別在0.047～1.510 μg、0.050～1.613 μg和0.059～1.882 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程依次為：Y=82 466.81X+281.83(r=0.999 9)、Y=886 294.46X+1 485.33(r=0.999 6)和Y=2 136 116.67X+5 884.29(r=0.999 8)。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) (1)日內(nèi)精密度 取同一混合對(duì)照品溶液(含兒茶素18.88 μg/ml、沒食子酸20.16 μg/ml、原兒茶酸23.52 μg/ml)重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，計(jì)算得到兒茶素、沒食子酸和原兒茶酸的日內(nèi)RSD分別為3.67%，3.47%和2.19%(n=6)。(2)日間精密度 取上述混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，每天1 次，連續(xù)6 d，記錄峰面積，計(jì)算得到兒茶素、沒食子酸和原兒茶酸的日間RSD分別為4.24%、3.89%和3.08%(n=6)。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(甘肅金塔)6份，精密稱定，分別按2.1(2)供試品溶液制備方法制備成6份樣品液，進(jìn)樣，分析。結(jié)果兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的平均含量分別為4.174、0.672、0.131 mg/g，RSD依次為4.18%、3.99%和4.13%(n=6)，表明本法的重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液，在24 h內(nèi)按擬定的時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)樣8 次，每次進(jìn)樣20 μl。樣品中兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸平均含量為4.177、0.672、0.131(mg/g)，RSD為4.84%、4.11%和4.32%(n=8)。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量(含兒茶素4.175 mg/g、沒食子酸0.672 mg/g、原兒茶酸0.133 mg/g)的鎖陽樣品(甘肅金塔)6份，分別加入一定量(兒茶素3.00 mg、沒食子酸1.33 mg、原兒茶酸0.249 mg)的對(duì)照品，按2.1(2)供試品溶液制備方法操作制備樣品液，進(jìn)樣20 μl。測(cè)得兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的平均回收率為100.59%、101.24%和97.90%(n=6)，RSD為3.35%、2.36%和3.14%(n=6)。

2.8 樣品含量測(cè)定 按照2.1(2)方法制備7批供試品溶液，每批3份。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl 進(jìn)樣，用峰面積外標(biāo)法計(jì)算。鎖陽藥材或飲片中兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的含量測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 鎖陽樣品的含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸3種成分中，兒茶素的吸收系數(shù)最小，原兒茶酸在鎖陽中的含量最低。在本研究的色譜條件下，原兒茶酸在258.7 nm處有最大吸收，為了更好地同時(shí)測(cè)定3種成分，因此將檢測(cè)波長(zhǎng)選為258.7 nm。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 本研究選用了乙腈-水系統(tǒng)的不同配比(25∶75、40∶60、10∶90、18∶82、5∶95、3∶97、4∶96、8∶92)，甲醇-水系統(tǒng)的不同配比(20∶80、50∶50)，乙腈-水-36%乙酸系統(tǒng)的不同配比(5∶95∶0.3、5∶95∶0.1、8∶92∶0.1、7∶93∶0.1、6∶94∶0.2、8∶92∶0.2)進(jìn)行流動(dòng)相的優(yōu)化。結(jié)果乙腈-水-36%乙酸系統(tǒng)有較好的分離及峰形，且隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的降低，兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸的保留時(shí)間增加，乙酸的加入使峰形更好。當(dāng)乙腈-水-36%乙酸為8∶92∶0.1時(shí)，分離效果好，分離時(shí)間短，所以選擇此流動(dòng)相系統(tǒng)作為本研究的流動(dòng)相。

3.3 7種藥材和飲片3種成分的含量 測(cè)定結(jié)果表明，藥材中3種成分的含量差異較大，沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素的含量差異分別達(dá)到6.4、7.6、45.7倍。因此需加強(qiáng)藥材質(zhì)量監(jiān)控，提高臨床用藥質(zhì)量。建議采用多種有效成分同時(shí)測(cè)定方法控制鎖陽質(zhì)量，對(duì)提升臨床治療效果意義重大。

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